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BioSense微生物快速立體計(jì)數(shù)儀

丹麥BioSense公司μCount3D微生物立體計(jì)數(shù)儀能在8分鐘內(nèi)對(duì)液體樣品中純培養(yǎng)的細(xì)菌、真菌孢子、酵母、微藻進(jìn)行計(jì)數(shù)。

μCount3D微生物立體計(jì)數(shù)儀，使用帶有三個(gè)樣品室的測(cè)量板，Count3D軟件展示總細(xì)菌/mL或真菌孢子/mL，并記錄圖像。

丹麥BioSense公司擁有全世界領(lǐng)先的傾斜倒置成像技術(shù)和機(jī)器視覺算法，專有的FluidScope傾斜攝像頭掃描技術(shù)提供精確和可重復(fù)的結(jié)果。

FluidScope傾斜攝像頭掃描技術(shù)原理：當(dāng)拍攝圖像時(shí)，拍攝的是一個(gè)體積而不是一個(gè)平面。每個(gè)圖像的高度為150 μm，由于圖像重疊，我們可以創(chuàng)建垂直和水平的Z堆棧。此體積中存在的所有對(duì)象都被聚焦捕獲。

技術(shù)參數(shù)

1 樣品種類：細(xì)菌、真菌、酵母、藻類。

2 儀器尺寸：長(zhǎng)20cm×寬10cm×高20cm。

3 樣品大小：0.5μm以上。

4 可計(jì)數(shù)范圍：1×10⁴?– 1×10⁷ 。

5 運(yùn)行時(shí)間：8 min。

6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)格式：個(gè)/mL、圖片、PDF報(bào)告。

7 樣品容器：BioSense三格樣品板。

8 可自設(shè)算法。

真菌孢子和細(xì)菌的計(jì)數(shù)

為了計(jì)數(shù)真菌孢子，我們使用深度學(xué)習(xí)算法來識(shí)別和計(jì)數(shù)樣本中的孢子。計(jì)數(shù)算法廣泛應(yīng)用于我們的oCelloScope?活細(xì)胞成像技術(shù)，并用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)作物科學(xué)和食品研發(fā)。我們支持一系列孢子和形態(tài)，甚至為科學(xué)家提供注釋工具來創(chuàng)建自己的算法。

對(duì)于細(xì)菌計(jì)數(shù)，我們使用體積成像法來計(jì)數(shù)整個(gè)體積中存在的細(xì)菌。細(xì)菌沉降非常緩慢，并且存在于整個(gè)成像體積中。因此我們可以捕獲所有細(xì)菌，可測(cè)量細(xì)菌小至0.5 μm像素。

1 μm質(zhì)控微珠的線性響應(yīng)

圖1 用μCount3D立體計(jì)數(shù)儀測(cè)量2倍稀釋的1 μm質(zhì)控微珠的線性響應(yīng)，R²=0.9992。線性響應(yīng)是評(píng)估計(jì)數(shù)系統(tǒng)性能的關(guān)鍵參數(shù)，它指的是計(jì)數(shù)系統(tǒng)在特定濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生與實(shí)際數(shù)量成正比的結(jié)果的能力。

圖1左圖顯示整個(gè)范圍1.6×10⁴–2×10⁶，圖1右圖顯示縮放范圍1.6×10⁴-3×10⁵。

芽孢桿菌孢子的線性響應(yīng)

圖2 使用μCount3D立體計(jì)數(shù)儀測(cè)量2倍稀釋的3種不同芽孢桿菌孢子（枯草芽孢桿菌，2種平行芽孢桿菌菌株）的商業(yè)殺線蟲劑產(chǎn)品的線性響應(yīng)，R²=0.9972。

圖2左圖顯示整個(gè)范圍2.3×10⁴-1.2×10⁷，圖2右圖顯示縮放范圍2.3×10⁴到7.5×10⁵。

μCount3D立體計(jì)數(shù)儀與瓊脂上的菌落計(jì)數(shù)的對(duì)比

我們建立了一個(gè)驗(yàn)證測(cè)試，使用μCount3D立體計(jì)數(shù)儀和瓊脂菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)來測(cè)量大腸桿菌。為了精確菌落計(jì)數(shù)，我們使用IntuGrow快速CFU/mL測(cè)定法（IntuBio，F(xiàn)arum，Denmark，www.IntuBio.dk）。

方案：大腸桿菌（K12）在TSB中生長(zhǎng)過夜。使用0.2 μm過濾器對(duì)10 mL 0.9%NaCl緩沖液進(jìn)行無(wú)菌過濾，以去除緩沖液中的顆粒。一夜之間，大腸桿菌在Eppendorf管中稀釋100倍，達(dá)到所需的起始濃度約1×10⁷。使用μCassetteB，65 μL/室（BioSense Solutions，F(xiàn)arum，Denmark）測(cè)量大腸桿菌濃度，一式三份。使用μCount3D算法：細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)起始濃度測(cè)量為6.97×10⁶，樣品離心管標(biāo)記為“1”。對(duì)于IntuGrow平板計(jì)數(shù)，將試管“1”進(jìn)一步稀釋，以達(dá)到預(yù)期的20-100個(gè)菌落計(jì)數(shù)。對(duì)于平板計(jì)數(shù)，將10 μL稀釋的樣品“1”用TSA在迷你瓊脂盤（丹麥法魯姆BioSense Solutions）上一式三份。將迷你瓊脂盤放置在12孔微量滴定板中，使用oCelloScope?對(duì)瓊脂表面進(jìn)行成像。使用IntuGrow軟件（IntuBio，F(xiàn)arum，Denmark）對(duì)新出現(xiàn)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。從原始試管“1”中，制備了含有500 μL 0.9%NaCl和500 μL樣品的2倍稀釋系列。將帶試管的架子置于寒冷條件下，以減少大腸桿菌的新分裂。總共進(jìn)行了8×2倍的稀釋。重復(fù)試管“1”的程序，對(duì)所有樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，一式三份。

結(jié)論：μCount3D立體計(jì)數(shù)儀和平板計(jì)數(shù)之間的比較測(cè)試顯示出非常好的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了4次，相關(guān)性相等。在所有實(shí)驗(yàn)中，平板計(jì)數(shù)略高于μCount3D立體計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)。我們推測(cè)這種差異可能是由移液引起的，因?yàn)棣藽ount3D立體計(jì)數(shù)儀使用的樣品直接來自稀釋樣品管，而用于平板計(jì)數(shù)的樣品會(huì)進(jìn)一步稀釋100-1000倍，并從中接種10 μL瓊脂，所以移液管的不準(zhǔn)確性可能是造成差異的原因。

圖3， TSB中過夜2倍稀釋的大腸桿菌培養(yǎng)物。藍(lán)線表示使用μCount3D立體計(jì)數(shù)儀的自動(dòng)計(jì)數(shù)。橙色線表示使用瓊脂平板測(cè)定法在TSA上的菌落計(jì)數(shù)。圖3線性響應(yīng)為R²=0.987。

圖4， μCount3D立體計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果與TSA菌落平板計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性。與圖3中使用的數(shù)據(jù)相同。圖4線性響應(yīng)為R²=0.991。

圖5， μCount3D立體計(jì)數(shù)儀的軟件視圖，顯示了實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌的三孔讀數(shù)。