婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基用丙氨酸和精氨酸，τ最長(zhǎng)可達(dá)33.5小時(shí)
婁地青霉菌因其用于生產(chǎn)藍(lán)紋奶酪而聞名，但它也是一種食物腐敗真菌，例如黑麥面包和乳制品。婁地青霉菌在高CO2濃度（高達(dá)84.8%）、低O2水平（低至0.3%）和低溫（低至0°C）下生長(zhǎng)的能力使該物種與其他絲狀生物區(qū)分開(kāi)來(lái)真菌并使其成為常見(jiàn)的腐敗真菌。婁地青霉菌有助于變質(zhì)通過(guò)空氣、水或其他載體分散大量稱為分生孢子的抗壓無(wú)性孢子。真菌分生孢子的萌發(fā)以活化、膨脹和胚管形成階段為特征97）。靜止分生孢子的激活導(dǎo)致孢子腫脹。在這個(gè)各向同性生長(zhǎng)時(shí)期之后是極化生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)生長(zhǎng)出菌絲的胚管。到目前為止，婁地青霉菌的營(yíng)養(yǎng)需求分生孢子未知。然而，已經(jīng)研究了水分活度(aw)、溫度和pH值對(duì)這些孢子萌發(fā)的影響。建模顯示婁地青霉菌分生孢子在-0.2至33°C的溫度下發(fā)芽，最佳溫度為26.9°C。最適pH值接近5.6，介于2.84和13.8之間，而水分活度(a w)的下限為0.83，最適pH值為0.98。當(dāng)暴露在最佳條件下10小時(shí)后開(kāi)始發(fā)芽。分生孢子的萌發(fā)也受到分生孢子生產(chǎn)過(guò)程中條件的影響。例如低溫和低aw，但不是pH值，在孢子形成過(guò)程中顯著減少了發(fā)芽時(shí)間。在這里，本論文研究人員研究了婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基要求。數(shù)據(jù)顯示，葡萄糖、丙氨酸和精氨酸可激活12-21%的分生孢子萌發(fā)。如果有的話，其他氨基酸在誘導(dǎo)發(fā)芽方面的效果要差得多。在所有情況下，在胚管形成之前，分生孢子的腫脹是最小的，甚至無(wú)法檢測(cè)到。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
在150μL NPS(70.6 mM NaNO3,11 mM Na2HPO4)的96孔懸浮培養(yǎng)的每孔中接種總數(shù)為6 10 3的孢子/NaH2PO 4(pH 6.0)、2 mM MgSO4)含有或不含有6.71 mM KCl和/或10 mM碳源（即葡萄糖或20種蛋白質(zhì)L-氨基酸中的一種）。MilliQ純水用作基線條件。使用oCelloScope(Biosense Solutions）在25°C下在線監(jiān)測(cè)分生孢子的萌發(fā)。使用UniExplorer軟件版本8.1.0.7682-RL2。培養(yǎng)1小時(shí)后開(kāi)始測(cè)量（使用生物三次重復(fù)和技術(shù)重復(fù)），使分生孢子能夠沉降在井底。在前24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)掃描一次物體，在接下來(lái)的48小時(shí)內(nèi)每2小時(shí)掃描一次。選擇其中的一個(gè)孔的一個(gè)子部分區(qū)域進(jìn)行分析。掃描區(qū)域長(zhǎng)度設(shè)置為4,05，對(duì)象區(qū)域（最小-最大）設(shè)置為70-1500像素，最大對(duì)象數(shù)設(shè)置為1500。使用oCelloScope XY坐標(biāo)和自定義R腳本隨時(shí)間跟蹤單個(gè)對(duì)象。分生孢子聚集體和t處的非分生孢子對(duì)象=1 h從數(shù)據(jù)集中手動(dòng)刪除。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
評(píng)估了婁地青霉菌分生孢子在水或由NaNO3、Na2HPO 4/NaH2O4、MgSO4組成的確定培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況和KCl(KNPS)補(bǔ)充或不補(bǔ)充葡萄糖或20種蛋白質(zhì)氨基酸之一。根據(jù)不對(duì)稱模型，在這些碳源中，只有葡萄糖、精氨酸和丙氨酸在72小時(shí)期間誘導(dǎo)發(fā)芽>10%。孢子的整體低發(fā)芽百分比（在精氨酸存在下獲得的最大百分比為21.18%）可以用低營(yíng)養(yǎng)條件來(lái)解釋，因?yàn)辂溠刻崛∥镏械陌l(fā)芽導(dǎo)致高達(dá)90%的孢子發(fā)芽，這是相似的與麥芽提取物瓊脂上的發(fā)芽率相比。特別是在存在精氨酸和丙氨酸的情況下，部分孢子形成了沒(méi)有可檢測(cè)到的腫脹的胚管。在純水中也觀察到了婁地青霉菌的萌發(fā)。分生孢子可能不需要外部觸發(fā)器來(lái)開(kāi)始發(fā)芽，但觸發(fā)器只是加速了這個(gè)過(guò)程。
圖1、用于描述青霉菌屬分生孢子在KNPS（6.71 mM KCl、70.6 mM NaNO3、11 mM Na2 HPO4/NaH2PO 4(pH 6.0)、2 mM MgSO 4）中形成胚芽管的不對(duì)稱模型，輔以10 mM精氨酸(A)、丙氨酸(B)、葡萄糖(C)、Milli-Q(D)作為對(duì)照。心點(diǎn)代表兩次技術(shù)重復(fù)的平均值。
圖2、非對(duì)稱模型的參數(shù)估計(jì)，用于描述婁地青霉菌芽管形成的芽管存在10mM葡萄糖(G)或10mM的蛋白質(zhì)源氨基酸(AA)之一的存在。
圖3、隨著時(shí)間的推移，在KNPS+精氨酸（紅色）、丙氨酸（綠色）或葡萄糖（藍(lán)色）中培養(yǎng)的婁地青霉菌的單個(gè)發(fā)芽分生孢子的像素中的Δ面積（面積t=x-面積t=1）。黑點(diǎn)顯示NPS+丙氨酸中正在發(fā)芽的A.niger分生孢子。
圖4、用oCelloScope(標(biāo)尺,15μm)檢測(cè)婁地青霉菌在KNPS+丙氨酸(a)、精氨酸(B)和葡萄糖(C)中的萌發(fā)情況。沉降1小時(shí)后開(kāi)始成像，間隔1小時(shí)(1-23小時(shí))和2小時(shí)(23-41小時(shí))。
圖5、干酪乳桿菌分生孢子在麥芽提取物肉湯中的腫脹示意圖。箭頭表示腫脹的分生孢子。
總結(jié)
婁地青霉菌用于生產(chǎn)藍(lán)紋奶酪，但也是一種腐敗真菌。它通過(guò)形成分生孢子進(jìn)行無(wú)性繁殖。這些孢子的萌發(fā)可以開(kāi)始食物的腐敗過(guò)程。發(fā)芽的典型特征是活化、膨脹和胚管形成過(guò)程。在這里，我們研究了婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)需求。研究中使用了oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系認(rèn)及時(shí)監(jiān)測(cè)在每種條件>300個(gè)分生孢子，并使用不對(duì)稱模型來(lái)描述發(fā)芽過(guò)程。孢子在NaNO3、Na2 PO 4/NaH2PO 4、MgSO 4中培養(yǎng)72小時(shí)和KCl與10 mM葡萄糖或20種蛋白質(zhì)氨基酸中的1種10 mM。在葡萄糖的情況下，形成胚管的最大孢子數(shù)(P max)為12.7%，而達(dá)到0.5 P max(τ)所需的時(shí)間約為14小時(shí)。精氨酸和丙氨酸是最具誘導(dǎo)性的氨基酸，其胚管形成的P max分別為21%和13%，τ最長(zhǎng)可達(dá)33.5小時(shí)。與真菌分生孢子萌發(fā)的典型階段相反，數(shù)據(jù)顯示婁地青霉菌分生孢子可以在沒(méi)有可檢測(cè)到的腫脹階段開(kāi)始形成胚管。
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