低鹽發(fā)酵甜瓣子體系中產(chǎn)生物胺的菌株與降解菌株能力研究【上】
甜瓣子發(fā)酵將為豆瓣醬提供豐富的游離氨基酸、有機(jī)酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及多種發(fā)酵微生物，是郫縣豆瓣生產(chǎn)的重要階段之一。目前，甜瓣子多采用高鹽度發(fā)酵，發(fā)酵的鹽度通常為12%～17%，成品豆瓣醬的鹽度高達(dá)16%～20%[1]。研究表明攝入過量的鹽分，可能會(huì)引起心腦血管、高血壓等疾病[2]。目前我國(guó)每人每天平均膳食鹽攝入量為（14.53±11.04）g[3]，遠(yuǎn)超過世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦攝入量5 g/d。豆瓣醬等高鹽調(diào)味品為我國(guó)膳食鹽分?jǐn)z入的主要來源，低鹽化已成為其發(fā)展的必然趨勢(shì)。對(duì)甜瓣子發(fā)酵低鹽化的研究具有重要意義。
低鹽發(fā)酵甜瓣子因體系鹽度較低，其游離氨基酸種類及含量相對(duì)較多，且發(fā)酵體系pH值相對(duì)較低，故極易造成生物胺等有害物質(zhì)積累[4]。生物胺是氨基酸在氨基酸脫羧酶的作用下脫羧生成的一類堿性次生代謝產(chǎn)物，過量攝入將造成一定的安全風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。使用生物技術(shù)控制發(fā)酵食品中生物胺含量已有較廣泛的研究，如Kung等[7]、OH等[8]、Guo等[9]均對(duì)發(fā)酵食品中降解生物胺微生物進(jìn)行篩選，并研究相關(guān)菌株的降解生物胺能力。然而，針對(duì)低鹽發(fā)酵甜瓣子體系中產(chǎn)生物胺的菌株及降解菌株的研究相對(duì)較少。本研究采用熒光檢測(cè)定性分析和高效液相色譜法定量分析，篩選甜瓣子中產(chǎn)生物胺和降解生物胺的菌株，并進(jìn)行回接驗(yàn)證，分析含鹽量和降胺菌株對(duì)甜瓣子產(chǎn)品安全性的影響，以期為低鹽甜瓣子生物胺含量的控制提供參考。
1試驗(yàn)材料
1.1試劑與儀器
丹磺酰氯、1，7-二氨基庚烷、脯氨酸、鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸、5-磷酸吡哆醛、硫胺素均為化學(xué)純，上海源葉生物科技集團(tuán)股份有限公司；腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、組胺、色胺、精胺、亞精胺均為色譜純，上海源葉生物科技集團(tuán)股份有限公司；氯化鈉、乙腈、乙醚、七水合硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀均為分析純，成都科隆化工有限公司；Ezup柱式真（細(xì)）菌基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程股份有限公司。
126-Ⅱ高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；凝膠成像儀，君意電泳有限公司；H2050R-1離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ESJ200-4A型分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；SPX-150B-4生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-82水浴恒溫振蕩器，常州市中貝儀器有限公司；GeneAmpR9700型PCR儀，美國(guó)ABI公司。
1.2試驗(yàn)所用培養(yǎng)基
生物胺顯色培養(yǎng)基：參考Sara等[10]方法略作修改后配制；以生物胺為唯一氮源培養(yǎng)基（BAs）：參考趙佳迪[11]的方法，略作修改后配制。
6%/9%/12%鹽度甜瓣子模擬體系（以100 mL計(jì)）：霉瓣子25 g+鹽4.5，9.4，13 g+5-磷酸吡哆醛0.005 g+碳酸鈣0.01 g+70 g水，混勻121℃，15 min滅菌。
6%鹽度含生物胺的甜瓣子模擬體系（以100 mL計(jì)）：霉瓣子25 g+鹽4.5 g+4 mL生物胺100 mg/L（8種）+5-磷酸吡哆醛0.005 g+碳酸鈣0.01 g+70 g水，混勻121℃，15 min滅菌。
2試驗(yàn)方法
2.1甜瓣子中產(chǎn)生物胺菌株篩選及其不同鹽度下產(chǎn)胺能力研究
2.1.1產(chǎn)胺菌株篩選稱取200 g霉瓣子，加入200 g飲用水，稱取16 g食用鹽，整個(gè)甜瓣子發(fā)酵體系的鹽度為4%，37℃發(fā)酵30 d。稱取10 g 4%鹽度甜瓣子，用生理鹽水逐級(jí)稀釋。選取適宜梯度的稀釋液100μL分別涂布于含有溴甲酚紫的固體顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h。挑取培養(yǎng)后使培養(yǎng)基變紫的菌株至LB培養(yǎng)基上分離、純化即為初篩菌株。將初篩菌株接種至液體顯色培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，以不接種菌株的顯色培養(yǎng)基為空白對(duì)照。37℃過夜培養(yǎng)，挑選培養(yǎng)后培養(yǎng)液明顯變紫的菌株初步判定為產(chǎn)生物胺的菌株。采用生工生物工程股份有限公司基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，分別利用PCR擴(kuò)增16S rDNA、18S rDNA和ITS序列，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，通過BLAST比對(duì)序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
2.1.2高效液相色譜法測(cè)定生物胺含量參考陳功等[12]建立的HPLC測(cè)定不同樣品生物胺含量的方法，略作修改，洗脫程序如表1所示。
表1生物胺檢測(cè)的洗脫程序
采用HPLC測(cè)定樣品生物胺含量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中生物胺的含量，所得含量明顯高于空白組的菌株即確定為產(chǎn)生物胺菌株。
2.1.3高產(chǎn)生物胺菌株回接至不同鹽度甜瓣子體系產(chǎn)生物胺能力研究將篩選得到高產(chǎn)生物胺的菌株回接于液體培養(yǎng)基（1 L）中，擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，4℃低溫離心10 min得到菌體，以108CFU/g回接至不同鹽度甜瓣子（6%，9%，12%）模擬體系中；以接種等量無菌水的滅菌甜瓣子模擬體系為空白對(duì)照，以該鹽度未滅菌甜瓣子接種等量無菌水為正常發(fā)酵甜瓣子對(duì)照，30℃恒溫發(fā)酵16 d后，測(cè)定甜瓣子中生物胺含量。
2.2生物胺降解菌株篩選及降解能力研究
2.2.1不產(chǎn)生物胺菌株篩選選取46株課題組前期從甜瓣子中篩出的不同菌屬菌株為研究對(duì)象，分別活化后接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，以接種等量無菌水為空白對(duì)照。恒溫培養(yǎng)48 h后，挑選顯色培養(yǎng)基不變紫的菌株初步判定為不產(chǎn)生物胺菌株。
2.2.2降解生物胺菌株篩選及其降解能力測(cè)定根據(jù)生物胺在熒光條件發(fā)色，生物胺含量與特定波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)原理，參考Judite等[13]方法略作調(diào)整后，建立熒光定性分析樣品中生物胺含量的方法，初步篩選提取液熒光強(qiáng)度弱于空白對(duì)照的菌株為可能降解生物胺的菌株。將初篩得到的降解生物胺菌株接種到BAs培養(yǎng)液中，以接種等量無菌水的BAs培養(yǎng)液為空白對(duì)照，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，觀察其菌株生長(zhǎng)情況并于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值，測(cè)定菌株在以生物胺為唯一氮源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。按上述方法對(duì)BAs培養(yǎng)液提取衍生后，再次測(cè)定熒光強(qiáng)度，選取熒光強(qiáng)度弱于空白對(duì)照組的菌株為降解生物胺菌株。高效液相色譜測(cè)定降胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量，并用公式（1）計(jì)算其生物胺降解率。
式中，X——生物胺降解率（%）；C1——空白組中生物胺濃度（mg/kg）；C2——接種菌株培養(yǎng)后培養(yǎng)液中生物胺濃度（mg/kg）。
2.2.3降解生物胺菌株回接甜瓣子模擬體系將篩選菌株回接到6%鹽度甜瓣子模擬體系中，以接種等量無菌水發(fā)酵體系為空白對(duì)照，30℃發(fā)酵30 d。根據(jù)表2甜瓣子感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)甜瓣子進(jìn)行感官評(píng)分并采用高效液相色譜測(cè)定甜瓣子模擬體系中生物胺含量。
表2甜瓣子感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14]
2.3數(shù)據(jù)分析
以上數(shù)據(jù)均做3個(gè)重復(fù)樣品，采用Excel、Origin、MEGA7對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及作圖。
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