摩加夫芽孢桿菌在防治水稻稻瘟病方面的應用進展
水稻是世界上最重要的糧食作物，但水稻的高產、穩產、優質一直受到病蟲害的制約。而稻瘟病是一種由子囊真菌稻瘟菌引起的世界性的水稻病害，是全世界稻區危害最嚴重的水稻病害之一。
由于稻瘟病的危害性與流行性，給水稻的產量帶來了巨大的損失，因此有效防治水稻稻瘟病是提高水稻產量的關鍵。在當今社會主要依靠化學農藥與抗性品種選育的方式來防治稻瘟病。近年來利用微生物來解決植物病害受到越來越多的關注。
生物防治通常是指利用活體微生物或者其代謝活性物質防治病原菌、害蟲和雜草以及調節植物生長的措施來預防或治療植物的病害，其具有效果穩定明顯、對環境的選擇壓力較小且不易使靶標病原菌產生抗藥性等特點，是一種新型安全高效的植物病害防治方式，可以有效地解決水稻稻瘟病高抗品種和化學農藥在生產上的局限性。
其中芽孢桿菌分布廣泛、環境耐受力強、可產生多種代謝產物，且芽孢桿菌生防菌劑穩定性及相容性較強，是目前用于植物病害生物防治研究最多的一類生防細菌。芽孢桿菌以其耐熱抗逆，環境友好等諸多優點成為近年生物防治研究的熱點，目前已經報道的防治農作物病害的芽孢桿菌有很多，比如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，但摩加夫芽孢桿菌在生物防治方面的報道還較少。
同時雖然生防芽孢桿菌抗病害的研究已經取得了較多成果，但生防產業化進程仍然任重道遠。在產業化進程中，既要攻克生防菌發酵生產的培養基配方以及最適于繁殖的生長條件等產業化生產等關鍵技術。解決上述問題需要技術所有者和生產單位付出更多的時間和精力，才可能實現生防技術從研究成果向批量生產，乃至于實際應用的產業化進程。
鑒于此，針對上述問題，深入研究，遂有本案產生。
下面提供一種芽孢桿菌MTC-8菌種制備方法及其應用，以解決上述背景技術中提出摩加夫芽孢桿菌在生物防治方面的應用上有不足，生防菌生產的培養基配方以及最適于繁殖的生長條件等產業化生產等關鍵技術仍有待突破的問題。
菌種材料：摩加夫芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）MTC-8，稻瘟菌菌株Guy11、Guy11-eGFP。
水稻材料：麗江新團黑谷（LTH），臺北309（TP309）。
將實驗室前期獲得的水稻內生菌及附生菌進行分離培養，收集可培養細菌332株，真菌及芽孢桿菌128株。將這些菌與稻瘟菌進行平板對峙試驗，先在制作好的CM平板上接種稻瘟病菌菌塊，恒溫培養4d后，在平板四周距稻瘟菌菌塊20mm處接種分離出的細菌，28℃恒溫倒置培養，2d后觀察并記錄有抑菌活性的菌株，篩選拮抗菌株。
經過平板對峙實驗篩選水稻內生菌及附生菌中的拮抗菌株，發現有抑制稻瘟病菌生長效果的拮抗菌株5株，根據其拮抗稻瘟病菌的效果，選取其中拮抗活性最強的菌種MTC-8進行后續實施例研究。
在NCBI網站上找到BLAST功能，將拮抗菌的序列上傳至網站并用GenBank數據庫進行比對搜索，比對結果顯示拮抗菌MTC-8的16SrDNA序列與摩加夫芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）的16SrDNA序列同源性最高，兩者的相似度在99%以上，再利用MEGA5.0軟件構建了系統發育進化樹。
MTC-8菌液培養時間的篩選
MTC-8生長曲線測定：按2%的接種量將MTC-8種子液加入到100mL滅菌后的玉米粉蛋白胨培養基中，于28℃、180r/min震蕩培養，分別取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的菌液測其吸光度（OD600），繪制生長曲線，以確定菌體數量最多的培養時間。
菌液中的菌體量取決于其培養時間，需要選擇菌液中菌落數量最大且穩定，并產生芽孢最多的時期用作微生物菌劑的配制。細菌的整個生長期包括延遲期、對數生長期、生長穩定期及衰亡期，菌株MTC-8的生長曲線如圖所示，MTC-8的延遲期較短，12h后開始進入增殖狀態并迅速進入對數生長期，在48h時菌落數達到最大，48h~72h時菌落數量進入穩定期，72h后菌落數量顯著下降，進入生長衰亡期。菌液培養時間在微生物菌劑的制作中發揮著重要作用，若培養時間過短，菌液中的菌體總數過少，且未能形成芽孢，菌體活性低，菌容易死亡；若培養時間過長，菌體活性降低且容易產生發酵產物。因此，在本實施例中可選擇生長穩定期48h~72h為菌液培養時間。
MTC-8芽孢率測定：按2%的接種量將MTC-8種子液加入到100mL滅菌后的玉米粉蛋白胨培養基中，于28℃、180r/min震蕩培養48h、60h、72h，備用。取三張潔凈的載玻片，選取合適位置分別滴加上述培養時間的菌液，用鑷子夾住載玻片于酒精燈外焰烘烤片刻，使菌液干燥并將菌種固定。向載玻片滴加數滴5%孔雀綠染色液覆蓋涂菌部位，于酒精燈加熱至染液冒蒸汽但并不沸騰并維持10min，加熱時注意補充染液，切勿讓染液干涸。待其略冷卻后，使用無菌水沖洗至無明顯染液脫出為止。滴加番紅染色液涂菌部位復染約2min，無菌水沖洗至至無明顯染液脫出為止。待干燥后油鏡觀察，菌體呈紅色，芽孢呈綠色。每個樣品取3個視野計數，在油鏡下計數芽孢個數及總體菌數，芽孢生成率=芽孢數/總菌數×100%。
為進一步確定MTC-8菌液培養時間，使用孔雀綠-番紅染色法對培養48h、60h、72h的MTC-8菌液進行染色，并對視野中的芽孢率進行統計，實驗結果：菌體呈紅色，芽孢呈綠色，48h、60h、72h的菌液中均產生了芽孢。對不同時間的芽孢產生率進行統計，72h時芽孢產生率最高，為66.7%，綜合上述結果，選取培養時間為72h的菌液制作MTC-8生防菌劑。
實驗結果表明，MTC-8微生物菌劑在田間對稻瘟病有良好的防治效果，預防效果要好于治療效果，其病斑數相較對照組減少了一半以上，和稻瘟靈防效相當。
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