實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)用于外源生物合成的苯丙氨酸相對(duì)含量的方法
苯丙氨酸作為8種必需氨基酸之一直接參與了生命活動(dòng)體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，對(duì)于生命活動(dòng)的正常進(jìn)行發(fā)揮著多方面的功能。其在體內(nèi)的合成由莽草酸循環(huán)與芳香族氨基酸合成兩部分組成，而每部分均包含了多個(gè)反應(yīng)步驟。苯丙氨酸在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，被證實(shí)在抗抑郁等醫(yī)學(xué)癥狀方面有很好的效果。另外，苯丙氨酸也為苯丙酮酸(Liu et al.，2015)和其他芳香族化合物的合成，以及多種植物次生代謝生物活性物質(zhì)，如黃酮類(lèi)化合物合成提供底物(Dempo et al.，2014)(圖1)。因此，苯丙氨酸在醫(yī)藥及保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中具有重要的地位，但目前研究表明，苯丙氨酸僅可以在植物和一些微生物體內(nèi)合成，而不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)生。同時(shí)苯丙氨酸在植物中的含量較低，其合成途徑往往伴隨著強(qiáng)烈的產(chǎn)物反饋抑制，因此近年來(lái)利用微生物細(xì)胞工廠(chǎng)合成氨基酸(Brey et al.，2020)成為了一種重要的替代方法。
在早期的研究中，更多的利用大腸桿菌和酵母作為氨基酸類(lèi)化合物異源生物合成的先驅(qū)平臺(tái)，并取得了系列的成果(Brey et al.，2020)。但氨基酸作為生命體的體現(xiàn)形式和初級(jí)代謝的重要底物，在細(xì)胞中并沒(méi)有過(guò)多的游離形式可用于生物工程當(dāng)中的異源產(chǎn)物合成。因此，生物工程研究人員往往通過(guò)基因工程改造以及不定向化學(xué)誘變等方法期望得到可以進(jìn)行高產(chǎn)苯丙氨酸合成的菌株。隨著全球氣候惡化等問(wèn)題目益突出，碳中性的光合生物合成底盤(pán)藍(lán)藻受到了更多的關(guān)注。藍(lán)藻作為合成底盤(pán)可以通過(guò)直接吸收空氣中的二氧化碳，產(chǎn)生附加值較高的生物活性物質(zhì)，且不與農(nóng)業(yè)搶耕地便于集約系統(tǒng)化培養(yǎng)，因此很快發(fā)展成為了一種新的綠色“生物智造”平臺(tái)，得到了極大的關(guān)注與發(fā)展(Jin et al.，2021)。
苯丙氨酸及其所衍生的大多數(shù)化合物往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜且分子量較大，產(chǎn)物通常無(wú)法自由透過(guò)細(xì)胞的膜壁結(jié)構(gòu)分泌到細(xì)胞外或透膜能力較低，因此產(chǎn)物的提取需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁。而藍(lán)藻由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性，生物酶解以及超聲破碎往往難以達(dá)到理想的效果，因此藍(lán)藻中苯丙類(lèi)化合物的提取往往包含了費(fèi)時(shí)費(fèi)工的細(xì)胞離心收集、高強(qiáng)度機(jī)械破壁、產(chǎn)物抽提以及利用高效液相色譜進(jìn)一步進(jìn)行儀器檢測(cè)，該傳統(tǒng)方法無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。如何在實(shí)際工作中對(duì)利用基因工程改造或化學(xué)誘變的細(xì)胞中苯丙氨酸相對(duì)含量進(jìn)行快速界定便成為了擺在研究人員面前的首要問(wèn)題。
本發(fā)明提供了一種利用密碼子簡(jiǎn)并性實(shí)時(shí)檢測(cè)藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)用于外源生物合成的苯丙氨酸相對(duì)含量的方法，包括以下步驟：
分別構(gòu)建含編碼苯丙氨酸的極端偏好密碼子和極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體，分別轉(zhuǎn)入藍(lán)藻中，得到含極端偏好密碼子的藍(lán)藻工程菌株和含極端稀有密碼子的藍(lán)藻工程菌株；
將構(gòu)建的含極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體轉(zhuǎn)入待檢測(cè)的藍(lán)藻菌株中，得到改造后的待測(cè)藍(lán)藻菌株；
將所述改造后的待測(cè)藍(lán)藻菌株和極端偏好密碼子的藍(lán)藻工程菌株、含極端稀有密碼子的藍(lán)藻工程菌株分別在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，比較三種菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，當(dāng)改造后的待測(cè)藍(lán)藻菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)比含極端稀有密碼子的藍(lán)藻工程菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)有顯著性提高時(shí)，則說(shuō)明所述待檢測(cè)的藍(lán)藻菌株細(xì)胞內(nèi)用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有優(yōu)勢(shì)。
優(yōu)選的，構(gòu)建含編碼苯丙氨酸的極端偏好密碼子或極端稀有密碼子的氯霉素基因的重組載體的方法，包括以下步驟：
將藍(lán)藻氯霉素基因中編碼苯丙氨酸的密碼子全部替換為T(mén)TT偏好密碼子，人工合成含強(qiáng)啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、極端偏好密碼子的氯霉素基因和基因翻譯終止子序列的融合基因片段，或者將藍(lán)藻氯霉素基因中編碼苯丙氨酸的密碼子全部替換為T(mén)TC稀有密碼子，人工合成含強(qiáng)啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、極端稀有密碼子的氯霉素基因和基因翻譯終止子序列的融合基因片段；
將合成的融合基因片段克隆至骨架載體中，得到重組載體；
將所述重組載體轉(zhuǎn)化至藍(lán)藻宿主中，得到含極端偏好密碼子的藍(lán)藻工程菌株或含極端稀有密碼子的藍(lán)藻工程菌株。
在本發(fā)明中，所述生長(zhǎng)曲線(xiàn)的比較時(shí)間優(yōu)選為培養(yǎng)120～160h，更優(yōu)選為144h。當(dāng)所述改造后的待測(cè)藍(lán)藻菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)越接近于極端偏好密碼子的藍(lán)藻工程菌株，遠(yuǎn)離含極端稀有密碼子的藍(lán)藻工程菌株，說(shuō)明待檢測(cè)藍(lán)藻菌株細(xì)胞內(nèi)用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有更好的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明對(duì)所述待檢測(cè)的藍(lán)藻菌株的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，可如本發(fā)明中通過(guò)添加外源氨基酸的方式，或者采用本領(lǐng)域所熟知的物理化學(xué)方法誘導(dǎo)獲得的潛在高產(chǎn)苯丙氨酸菌株以及基因工程改造的高產(chǎn)苯丙氨酸的藍(lán)藻菌株均可。
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