中藥單體組合物綠原酸、黃芩苷、厚樸酚對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響
摘要：旨在研究由不同單體組成的中藥單體組合物對(duì)多重耐藥大腸桿菌的抑菌作用。通過最小抑菌濃度（MIC）、分級(jí)抑菌指數(shù)（FICI）、中藥單體組合物的篩選、中藥單體組合物的劑量配比優(yōu)化等試驗(yàn)，獲得一種由綠原酸、黃芩苷、厚樸酚按照質(zhì)量比為2∶4∶1的中藥單體組合物。通過測(cè)定中藥單體組合物對(duì)多重耐藥大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線、相對(duì)電導(dǎo)率、核酸和蛋白滲漏、胞外堿性磷酸酶（AKP）含量、胞內(nèi)DNA含量變化的影響，初步探究中藥單體組合物對(duì)多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌作用。結(jié)果顯示：綠原酸、黃芩苷、厚樸酚、硫酸小檗堿對(duì)多重耐藥大腸桿菌的MIC分別為6.25、6.25、6.25和1.25 mg/mL,不同組分之間存在協(xié)同或相加作用，其中綠原酸和厚樸酚聯(lián)用的FICI為0.5.中藥單體組合物可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)容物滲漏使菌液的電導(dǎo)率顯著升高（P<0.05），菌液OD260 nm、OD280 nm值顯著升高（P<0.05），AKP含量顯著升高（P<0.05），DNA含量變化明顯。本研究表明中藥單體組合物主要通過破壞多重耐藥大腸桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性從而實(shí)現(xiàn)抑菌作用，為中藥復(fù)方治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病的藥物篩選和研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
大腸桿菌病是威脅畜禽養(yǎng)殖的頭號(hào)細(xì)菌病，是由大腸桿菌感染引起的一種多發(fā)的傳染性疾病。隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度不斷提高，畜禽大腸桿菌病在各地的流行趨于嚴(yán)重。畜禽患病后引起急性敗血癥或多組織器官炎癥從而影響畜禽繁殖機(jī)能，甚至可能導(dǎo)致畜禽死亡，對(duì)畜禽養(yǎng)殖戶造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)禽大腸桿菌病主要是采用抗生素治療，但是隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，耐藥譜的不斷增加，給禽大腸桿菌病的防治帶來了重重困難。在國(guó)家“減抗”、“替抗”政策的推動(dòng)下，在大腸桿菌疫苗效果不理想、耐藥菌株不斷出現(xiàn)的情況下，中草藥因其來源廣泛、藥理作用多樣且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)吸引了研究者的廣泛關(guān)注，其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。中草藥及其提取物對(duì)細(xì)菌、真菌都有較好的抗菌效果。然而單味中藥效果單一，而復(fù)方中藥因存在多個(gè)有效部位，具有多層次的復(fù)合效果，因此開發(fā)替代抗生素的低毒或無毒副作用、安全高效的抗微生物復(fù)方中藥是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。根據(jù)中獸醫(yī)辨證論治原則，雞大腸桿菌病可辨為濕熱證，應(yīng)選擇清熱燥濕，涼血止痢的中藥。黃芩、黃連性味苦、寒，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效；金銀花性味甘、寒，有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效；厚樸性味苦、辛、溫，有行氣燥濕，逆降平喘之功效。諸藥合用，共奏清熱解毒、化濕和中理氣之功效。黃芩苷、小檗堿、厚樸酚、綠原酸分別為我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芩、黃連、厚樸、金銀花中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多重功效。
本試驗(yàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，通過體外篩選敏感中藥單體以及結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化出中藥單體組合物最優(yōu)配比。探討中藥單體組合物對(duì)禽致病性大腸桿菌的抑菌作用，為今后禽大腸桿菌病的防控提供理論依據(jù)，為解決禽致病性大腸桿菌日趨嚴(yán)重的耐藥性問題提供一種新的治療策略，為治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病的中藥復(fù)方藥物篩選和研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將細(xì)菌劃線接種在LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好的單一菌落接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于37℃、220r/min的條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜孵育。將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌懸液按照1∶100的比例接種于無菌的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯（稀釋至106CFU/mL），然后在菌懸液中分別加入不同藥物配制相應(yīng)的濃度，每種組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)。相同體積的單獨(dú)加入藥物無菌LB營(yíng)養(yǎng)肉湯作為對(duì)照，混合液放入恒溫振蕩器（37℃、220r/min）中培養(yǎng)。通過檢測(cè)評(píng)價(jià)不同藥物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，0——18h,每隔1h測(cè)定菌液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值，單獨(dú)加入藥物的營(yíng)養(yǎng)肉湯用于空白調(diào)零。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。
中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響
如圖1可知，未經(jīng)處理的多重耐藥大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型，大約在培養(yǎng)6——8h左右到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌在14h之后數(shù)量趨于平穩(wěn)。與空白組相比，在培養(yǎng)的初始階段添加不同濃度的中藥單體組合物后，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制。在同一培養(yǎng)時(shí)間下，3種濃度中藥單體組合物處理后的菌液的OD值均低于空白對(duì)照組，且菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間滯后，當(dāng)添加1/2MIC、1MIC的中藥單體組合物后，細(xì)菌的生長(zhǎng)被抑制，平穩(wěn)期的數(shù)量降低。而2MIC濃度中藥單體組合物與細(xì)菌作用后，細(xì)菌的生長(zhǎng)被完全抑制，培養(yǎng)周期內(nèi)OD值基本沒有變化，說明本研究篩選到的中藥單體組合物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)情況有抑制作用。
圖1中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚對(duì)大腸桿菌E——32生長(zhǎng)曲線的影響
中藥可從通過影響細(xì)菌生長(zhǎng)、干擾細(xì)胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細(xì)胞蛋白合成、影響核酸合成等多方面表現(xiàn)抗菌作用。通過測(cè)定黃連配方顆粒、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及鹽酸小檗堿對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線等試驗(yàn)的影響，研究了其對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理。本試驗(yàn)篩選出最優(yōu)中藥單體組合物綠原酸——黃芩苷——厚樸酚并探究了其對(duì)多重耐藥大腸桿菌生長(zhǎng)情況的影響，發(fā)現(xiàn)中藥單體組合物對(duì)細(xì)菌的抑制作用與時(shí)間和濃度有關(guān)，1/2MIC和1MIC處理組的抑菌效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，而2MIC組在0——18h的抑菌曲線保持不變，說明濃度為2MIC時(shí)可以完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，綠原酸、黃芩苷和厚樸酚組成的中藥單體組合物具有很好的抗菌能力。
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