基于MALDI-TOF微生物質(zhì)譜菌種快速鑒定技術(shù)，助力微生物鑒定和污染溯源調(diào)查
近日，上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院宋明輝博士發(fā)表在《Frontiers in Microbiology》期刊上的論文《A comprehensive technology strategy for microbial identification and contamination investigation in the sterile drug manufacturing facility—a case study》受到了行業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注和討論[1]。該文章詳細(xì)闡述了一種創(chuàng)新的綜合技術(shù)策略-基于MALDI-TOF微生物質(zhì)譜菌種快速鑒定技術(shù)和全基因組測序菌株分型技術(shù)，為制藥企業(yè)在無菌藥品生產(chǎn)車間中進(jìn)行微生物鑒定和污染溯源調(diào)查提供了全新的視角和有效的技術(shù)手段。文章的發(fā)表對于提高制藥企業(yè)的生產(chǎn)質(zhì)量控制水平、保障藥品安全具有重要意義，為行業(yè)內(nèi)相關(guān)問題的解決提供了寶貴的參考和借鑒。
圖1.菌株監(jiān)測和溯源完整過程的示意圖
前言：
微生物污染一直是藥品制造面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。藥品，特別是注射劑和眼科藥品等高風(fēng)險(xiǎn)無菌產(chǎn)品，一旦在生產(chǎn)和儲存過程中發(fā)生污染，可能會造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，嚴(yán)重情況下，甚至?xí)p害患者的健康和生命。統(tǒng)計(jì)表明，在2012年至2019年期間，美國FDA注冊藥品的所有召回中，有50%以上與微生物污染有關(guān)[2，3]。
了解藥品生產(chǎn)過程中環(huán)境微生物的類型和分布是藥企過程監(jiān)測計(jì)劃的重要部分，高效的微生物鑒定和表征策略對于有效的微生物污染控制至關(guān)重要。
目的：
本研究旨在基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，輔以測序技術(shù)，建立無菌藥品生產(chǎn)過程中微生物鑒定和污染調(diào)查的綜合策略，以監(jiān)測污染菌并分析其分布特征和模式。
方法：
對無菌藥品生產(chǎn)過程涉及的各個(gè)要素，包括原材料、人員、環(huán)境和生產(chǎn)用水系統(tǒng)，進(jìn)行采樣和菌株的分離培養(yǎng)，通過MALDI Biotyper質(zhì)譜進(jìn)行菌種鑒定，輔以測序技術(shù)進(jìn)行菌株鑒定和分型，再對檢測結(jié)果進(jìn)行分析和評估。
結(jié)果：
從無菌藥品生產(chǎn)車間歷時(shí)3個(gè)月的環(huán)境監(jiān)測項(xiàng)目中，共分離出292個(gè)菌株。細(xì)菌污染分布如表1所示，最大的污染源是生產(chǎn)環(huán)境（212株），占所有分離菌株的70%以上，其次是水系統(tǒng)（39株）。
表1.不同地點(diǎn)微生物的菌株、菌種和菌屬數(shù)量分布。
根據(jù)菌株的分離部位、生長特征和菌落形態(tài)等信息，排除可能的重復(fù)菌株后，剩余241個(gè)菌株。鑒定結(jié)果表明，241個(gè)菌株分屬于44個(gè)菌屬的94個(gè)菌種。菌株數(shù)排名前5的主要污染菌約占菌株總數(shù)的70%，分別屬于葡萄球菌（40.25%）、微球菌（11.20%）、芽孢桿菌（8.30%）、放線菌（5.81%）和類芽孢桿菌（4.56%）。19個(gè)優(yōu)勢菌種占所有94個(gè)菌種的64%，包括占明顯優(yōu)勢的9種葡萄球菌，其中出現(xiàn)10次以上的有科氏葡萄球菌（33）、表皮葡萄球菌（27）和人葡萄球菌（10）。
科氏葡萄球菌出現(xiàn)了33次，分別出現(xiàn)于環(huán)境（A級3次、B級7次、C級20次）、人員（2次）和原材料（1次）中，證明其在整個(gè)過程中廣泛存在。科氏葡萄球菌出現(xiàn)于環(huán)境監(jiān)測的兩個(gè)關(guān)鍵區(qū)域，大多數(shù)（28/33）科氏葡萄球菌分離于制劑生產(chǎn)區(qū)，只有5個(gè)來自原料藥生產(chǎn)區(qū)。在從制劑生產(chǎn)區(qū)分離的28個(gè)科氏葡萄球菌株中，有兩個(gè)來自A級潔凈區(qū)。
圖2.不同監(jiān)測地點(diǎn)優(yōu)勢菌屬的分布
為了確定其來源，作者開發(fā)了一種更具鑒別性的全基因組SNP分型方法來追蹤傳播途徑。cgMLST將28個(gè)分離菌株分為11種基因型（SID=0.765），其中包含兩個(gè)以上菌株的有A、B和C三個(gè)型。從制劑生產(chǎn)區(qū)的A級關(guān)鍵區(qū)域——層流柜中分離到的菌株H71和13個(gè)近緣分離株（20到172個(gè)SNP差異）被聚類為A型。菌株H71與C級區(qū)域幾個(gè)采樣點(diǎn)分離的菌株密切相關(guān)，即氣閘（G2、G1、G32、G39、F28）、封蓋室（H28、G30 F30）、走廊（F8、G19）等，這表明A級表面的污染很可能來自潔凈度級別較低的C級區(qū)域，通過物質(zhì)、空氣或人員流動進(jìn)行傳播。在A級區(qū)域發(fā)現(xiàn)的菌株K6與從工作人員右手手腕上分離的菌株H66（38個(gè)SNP）密切相關(guān)，同屬于B型，表明通過不良的人員操作或流動引入污染的可能性很高。
圖3.28株污染菌科氏葡萄球菌的wgSNP分型結(jié)果。
結(jié)論
MALDI Biotyper微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)一天內(nèi)即可完成所有菌株的鑒定，在菌種水平和菌屬水平的鑒定能力分別為75.8%和95.4%，不僅速度快、通量高，而且準(zhǔn)確性和可靠性高，有望成為例行環(huán)境監(jiān)測的一線工具。
從原料和環(huán)境表面分離出來的產(chǎn)孢菌分別為58%和32%，說明了原料質(zhì)量控制和轉(zhuǎn)移消毒的重要性。
基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本案例中的環(huán)境污染主要與人員流動相關(guān)。菌株分型結(jié)果為后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)評估提供了準(zhǔn)確可靠的信息，為采取有效的預(yù)防和糾正措施提供了很好的技術(shù)支撐。
本研究創(chuàng)新性地建立了主要基于MALDI Biotyper質(zhì)譜菌種鑒定技術(shù)和全基因組測序菌株分型技術(shù)的無菌藥品生產(chǎn)過程中微生物鑒定和污染調(diào)查的綜合策略。該策略將促進(jìn)制藥行業(yè)開發(fā)改進(jìn)生產(chǎn)和環(huán)境控制的流程，并指導(dǎo)如何為優(yōu)化質(zhì)控計(jì)劃提供更合理可靠的證據(jù)。
編者注：
在本研究中，布魯克MALDI Biotyper微生物質(zhì)譜快速鑒定系統(tǒng)在該綜合技術(shù)策略中發(fā)揮著快速高效的作用。即便該研究中微生物質(zhì)譜鑒定采用的是2019年的數(shù)據(jù)庫，但在微生物鑒定方面已經(jīng)具有很高的準(zhǔn)確率。而且，布魯克每年都在持續(xù)更新數(shù)據(jù)庫，隨著MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫的不斷更新，其鑒定范圍和準(zhǔn)確率還會持續(xù)提高。
近期，已有研究把IR Biotyper全自動紅外光譜微生物分型溯源系統(tǒng)應(yīng)用于藥品生產(chǎn)企業(yè)中的溯源、質(zhì)控以及WGS分析的初篩工作。
可以相信，布魯克MALDI Biotyper與IR Biotyper相結(jié)合的監(jiān)測方案在制藥微生物監(jiān)測領(lǐng)域中，因其具備微生物快速鑒定、分型和溯源分析的能力，同時(shí)具有檢測速度快、成本低以及可實(shí)現(xiàn)全面監(jiān)測等優(yōu)勢，能夠?yàn)橹扑幤髽I(yè)提供更為有效的微生物監(jiān)測解決方案，進(jìn)而確保藥品生產(chǎn)的安全性與質(zhì)量。
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