東北某市寒區湖庫型主體水和生物膜中耐氯菌數目、再生長現象研究（一）
由于氯的消毒效率高、穩定性好、易于使用、成本低廉等優勢，仍然是使用最廣泛的消毒劑。研究發現在保持一定余氯濃度的條件下，仍然有細菌能夠存活，甚至有一部分細菌能夠在含有較高余氯濃度的自來水廠、管網等供水系統中生存。這些對氯具有較高耐受性的細菌被稱作“耐氯菌”（chlorineresistant bacteria，也譯為“抗氯菌”）。然而，由于消毒效率跟測試的條件、方法密切相關，在科學的范疇上，耐氯菌的耐受性只是一個相對的概念，并不是一個準確的術語。
加氯消毒的過程本身就是對耐氯菌選擇的過程，也會使耐氯菌成為優勢菌。這些存在于供水系統中的耐氯菌會對飲用水的安全性造成巨大危害。一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者條件致病菌，如分枝桿菌（Mycobacteriumspp.）、軍團菌（Legionellaspp.）、銅綠色假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等；另一方面，由耐氯菌導致氯消毒的失效，并由此引發供水管網中的細菌再生長，進一步增加了細菌的耐氯性，使得供水管網中的細菌狀況進一步加劇，進而引起用戶龍頭水細菌總數、色度、濁度等水質指標超標。由于耐氯菌處于一個貧營養條件下并維持較高濃度余氯的極端環境體系下，大大限制了對供水管網中耐氯菌的研究。為此，對東北某市寒區湖庫型水源凈水廠加氯前后和供水管網中不同水齡、管道材質、管齡的主體水和生物膜中耐氯菌的變化規律進行研究，以期為供水微生物安全的評估、預防和控制提供理論基礎。
1實驗
1.1寒區湖庫型水源供水系統描述
該供水系統由典型的寒區湖庫型水源凈水廠供水，原水濁度為0.34——14 NTU，pH 6.10——7.49，堿度（CaCO3）8——48 mg/L，氨氮為0.04——0.20 mg/L.檢測數據均值中除大腸菌群為Ⅱ——Ⅲ類外，其他項目均滿足Ⅱ類水質。凈水廠建于2006—2009年，常規處理工藝為機械混合+水平軸機械絮凝+斜管沉淀+雙層濾料翻板濾池過濾+液氯消毒，設計總供水能力90×104m3/d，目前實際最高日供水量約為79×104m3/d，平均日供水量67×104m3/d.
根據該市的區域供水管網特征和水質特點，選取具有代表性的供水管網開展對比分析，該供水系統取樣點基礎信息見表1。
表1供水系統取樣點基礎信息
1.2分析測定方法
在該市某凈水廠清水池和供水系統（二次供水水箱）清洗期間（一般1年清洗1次，清洗時間為4月末—6月初或9—10月），于凈水廠濾池生物膜直接采集濾池反沖洗前期廢水顆粒（干樣約為10 g），采集清水池出水端下部高0.5 m處面積約50 cm×50 cm的池壁生物膜，水廠食堂連接水龍頭PPR管面積約100 cm2的管內壁生物膜，二次供水水箱進水端下部高0.15 m處面積約30 cm×30 cm池壁生物膜。在清洗前，開展供水系統的主體水水質測定，為期1 a，每月采集水樣一次，包括水廠濾后水、清水池出水、食堂龍頭水和各二次供水水箱市政進水5 L.所采得的生物膜和主體水水樣及時運回實驗室，并保存于4℃冰箱，在8 h內進行相關項目的分析。其中耐氯性細菌檢測的水樣與生物膜在同一時期內采集。
1.2.1生物膜和進出水異養菌平板計數（HPC）測定
將待計數的生物膜懸浮液置于超聲波振蕩器中冰浴超聲振蕩1 min，間歇1 min，如此重復3次，然后再漩渦振蕩30 s，使生物膜中的細菌能夠均勻分布在懸浮液中，之后將懸浮液稀釋適宜質量濃度在R2A固體培養基上進行異養菌總數平板計數（HPC-R2A）。R2A固體培養基主要成分：酵母0.5 g，酪蛋白酸水解物0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，胰蛋白胨0.25 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L;并用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉調節pH為7.2——7.4.主體水、濾后水和供水末端水樣直接倍比稀釋，涂布于R2A固體培養基上；清水池和供水前端水樣用0.22μm濾膜過濾10——100 mL的水樣，然后將濾膜截濾微生物的一面向上貼于R2A固體培養基上進行HPC計數。將處理好的R2A培養基平板放于20℃倒置恒溫培養10 d，即可獲得異養菌平板計數。
1.2.2耐氯性細菌檢測
耐氯性細菌檢測參考陸品品和Mathieu等的方法，并做適當修改。對于生物膜樣品，在加氯前，引入超聲波和漩渦振蕩法分散細胞群體生物膜，使生物膜中的個體細胞釋放出來，盡量減少消毒劑在生物膜基質中擴散限制和反應抑制作用，使得氯能滲透到更多細菌個體細胞表面，耐氯的細菌得以檢出。檢測方法如圖1所示，將混勻的生物膜懸浮液（經1.2.1方法處理）和主體水樣品，置于經過滅菌處理的取樣瓶（1 L棕色細口瓶，密封）。其中1份樣品保持一定質量濃度的Cl2消毒劑（根據出廠水的平均余氯質量濃度，加入NaClO溶液使pH調至近中性。由于生物膜懸浮液會消耗更多的余氯，在生物膜懸浮液中比主體水中多加20%——50%的余氯溶液，混勻，待余氯穩定后再測余氯質量濃度，使主體水和生物膜懸浮液的余氯終質量濃度均保持在0.60 mg/L），常溫過夜靜置12 h（根據該市的區域供水管網特征和水質特點，選取處于該市供水管網中間位置的H5采樣點的水力停留時間，具有代表性）；另1份樣品加入Na2S2O3，中止消毒，冷藏保存。12 h后，依據1.2.1的檢測方法取樣測定這2瓶水樣中的HPC-R2A值，重復3次以中止消毒樣品中HPC-R2A值作為管網出水細菌本底值，另一份樣品為維持消毒劑作用12 h后HPC-R2A值，作為管網出水可能的耐氯菌檢測值。
圖1耐氯性細菌檢測方法示意
1.2.3主體水其他水質測定方法
1.2.4掃描電鏡觀察
采用掃描電鏡觀察上述生物膜的形態，掃描電鏡樣品前處理方法：樣品在2.5%的戊二酸溶液中4℃固定過夜；倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min;冷凍干燥；樣品黏附在樣品臺上，噴金，在Quanta 200環境掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）上觀察。
1.3數據處理方法
耐氯性細菌檢測時加入0.60 mg/L的Cl2，經12 h的滅活率為D=log10（N0/Nc），其中N0為不加氯12 h后的HPC-R2A值，Nc為加氯12 h后的HPC-R2A值。運用SPSS 13.0統計分析軟件對常規指標和細菌總數等進行方差分析和相關性分析。