朱鹮細(xì)胞系的建立、體外生長(zhǎng)特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（二）
1.3細(xì)胞生長(zhǎng)評(píng)價(jià)
參照Mosmann(1983)的方法,測(cè)定5、10、20和25代的細(xì)胞生長(zhǎng)率。細(xì)胞按1×104個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔接種180μL。37°C培養(yǎng)24 h后,每孔加入20μL濃度為5 mg/mL的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5)-dimethylthiazol(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,Sigma],重復(fù)做5個(gè)孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸出上清,每孔加入150μL的DMSO,10 min后,于振蕩器上振搖10 min,并在酶標(biāo)儀(BIORAD-680)上測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(optical density value,OD)。以后每天按此方法測(cè)定5孔細(xì)胞的OD值,連續(xù)測(cè)定7 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
1.4免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞來源
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到置于6孔板內(nèi),且已滅菌的7 mm×22 mm蓋玻片上,培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液,用冰冷的PBS漂洗3次;4%的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞15 min,用含0.03%Triton-100的PBS(PBST)漂洗3次,每次5 min;加入1%BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白,Amresco)室溫封閉20 min,PBS漂洗3次,每次5 min;分別加鼠抗人波形蛋白和鼠抗人平滑肌α-actin(肌動(dòng)蛋白)單克隆抗體(1:200,Dako),4°C孵育過夜;PBS漂洗細(xì)胞3次,每次3 min,加入Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗,37°C孵育30 min;PBST漂洗3次,每次5 min,用含DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-diamidino-2-phenylindole,Sigma)的封片液封片后,熒光顯微鏡下觀察并照相。
1.5細(xì)胞遺傳學(xué)分析
1.5.1染色體標(biāo)本制備在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,每10 mL培養(yǎng)液加入20μL秋水仙素(100μg/mL,Sigma),處理細(xì)胞60 min后棄去培養(yǎng)液;用0.25%胰酶消化細(xì)胞1～2 min,然后加入適量的生長(zhǎng)液抑制胰酶作用;混勻細(xì)胞懸液,離心后棄上清,用0.075 mol/L KCl溶液低滲處理細(xì)胞15 min,離心后加入甲醇:冰乙酸(3:1)固定細(xì)胞3次;以空氣干燥法制片。
1.5.2染色體帶型分析
參照Seabright(1971),Summer(1972)和Goodpasture&Bloom(1975)的方法進(jìn)行G帶、C帶和Ag帶顯示。
1.5.3熒光原位雜交參照Nie et al(2009)的方法,利用石鸻(Burhinus oedicnemus,鸻形目)的Z和W染色體特異探針與朱鹮的中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交,鑒別朱鹮的性染色體。
1.6圖像拍攝與分析
用裝有CCD攝像裝置的蔡司熒光顯微鏡(Axioplan 2,Zeiss company)和圖像分析軟件(CytoVision system,Applied Imaging Corp,UK)進(jìn)行圖像拍攝和分析。
2結(jié)果與討論
2.1朱鹮皮膚細(xì)胞系的建立
在陜西朱鹮人工繁殖中心獲得兩只朱鹮(雌、雄各一只)的皮膚樣品后,置于運(yùn)輸液中運(yùn)送到昆明。原代培養(yǎng)15 d后,有細(xì)胞從組織塊周圍長(zhǎng)出(圖1 A),繼續(xù)培養(yǎng)5 d后細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層(圖1 B),即可以1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),以維持細(xì)胞增殖。我們對(duì)10代以前不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存,成功建立了兩株朱鹮細(xì)胞系,分別命名為KCB 201253S（雄性)和KCB 2012055S（雌性)。細(xì)胞均為典型的成纖維樣細(xì)胞,且支原體污染檢測(cè)（熒光法)結(jié)果均為陰性。凍存的朱鹮細(xì)胞在復(fù)蘇后能夠正常生長(zhǎng),且生長(zhǎng)速度與凍存前相比并未減低。
圖1培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞形態(tài)
為優(yōu)化培養(yǎng)條件,我們選用了不同的培養(yǎng)基如DMEM、MEM和OPTI-MEM(GIBCO)同時(shí)培養(yǎng)朱鹮細(xì)胞,并添加相同比例牛血清,經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)OPTI-MEM培養(yǎng)基最適宜朱鹮細(xì)胞的生長(zhǎng)。
為鑒別所建立的朱鹮細(xì)胞系的來源,我們采用免疫熒光染色的方法,用兩種不同的抗體對(duì)培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞進(jìn)行免疫抗體染色。結(jié)果顯示在朱鹮細(xì)胞中鼠抗人波形蛋白抗體染色為陰性,而鼠抗人平滑肌α-actin抗體染色為強(qiáng)陽性(圖2,呈束狀的紅色熒光顯示肌絲特征)。鼠抗人平滑肌α-actin抗體只與血管平滑肌細(xì)胞中的actin的α異構(gòu)體特異性結(jié)合,而與成纖維細(xì)胞中的β-、γ-actin均不能結(jié)合。因此該抗體可以作為血管平滑肌細(xì)胞的鑒定(Cai et al,2005)。免疫熒光染色的結(jié)果提示我們建立的朱鹮細(xì)胞系來源于血管平滑肌組織。體外培養(yǎng)細(xì)胞源于動(dòng)物機(jī)體,而機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長(zhǎng),每一種組織都有血管和間葉組織,因此,由動(dòng)物體來源的培養(yǎng)材料而進(jìn)行的原代培養(yǎng),絕大多數(shù)都呈各種細(xì)胞混合生長(zhǎng)（Zhou,2006)。我們所取的朱鹮皮膚樣品中也含有血管,在剪小的組織塊中包含有血管平滑肌組織,在原代培養(yǎng)時(shí)包括血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的各類細(xì)胞均可從組織塊中長(zhǎng)出,因此,可能在后續(xù)的傳代培養(yǎng)過程中,血管平滑肌細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞而保留下來。
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