微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)&光學延時顯微鏡用于快速評估吸濕性食品樣品中的微生物質量
研究背景：本研究探索了一種基于光學延時顯微鏡（Optical Time-Lapse Microscopy）的快速微生物檢測技術，用于評估吸濕性食品樣品（如卡拉膠）中的微生物質量。這項研究由丹麥技術大學國家食品研究所和IntuBio ApS合作完成，旨在解決傳統(tǒng)微生物檢測方法在處理吸濕性食品時面臨的挑戰(zhàn)，并提供一種更快速、準確的替代方案。卡拉膠是一種從紅藻中提取的水溶性膠體，廣泛應用于食品工業(yè)中作為凝膠劑、增稠劑或穩(wěn)定劑。
然而，其吸濕性特性使得傳統(tǒng)的平板計數(shù)法在檢測微生物污染時面臨諸多問題，如樣品膨脹、形成凝膠團塊、堵塞移液管以及在瓊脂平板上形成氣泡和雜質，導致計數(shù)困難且容易出錯。此外，傳統(tǒng)平板計數(shù)法需要長達72小時的培養(yǎng)時間，這對于食品制造商快速釋放產(chǎn)品和提高食品安全性提出了挑戰(zhàn)。為了解決這些問題，研究團隊開發(fā)了一種基于光學延時顯微鏡的檢測方法，利用IntuGrow系統(tǒng)對微型平板（mini agar plates）進行實時成像和分析。該方法通過將卡拉膠粉末夾在兩層瓊脂之間，避免了樣品膨脹對檢測的影響，并通過DELAY算法對圖像進行處理，消除了背景噪聲和卡拉膠膨脹帶來的干擾。
實驗結果表明，該方法能夠在12-20小時內完成檢測，相比傳統(tǒng)平板計數(shù)法（72小時）大大縮短了檢測時間。研究團隊對14種不同污染水平的卡拉膠樣品進行了測試，結果顯示，光學延時顯微鏡法與傳統(tǒng)平板計數(shù)法之間存在幾乎完美的相關性（Deming回歸斜率為0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差。這表明，盡管光學延時顯微鏡法能夠快速、準確地檢測微生物，但在某些情況下可能會低估微生物數(shù)量。此外該方法的檢測限為50 CFU/g，略高于傳統(tǒng)平板計數(shù)法（40 CFU/g），但其快速檢測的優(yōu)勢使其在工業(yè)應用中具有巨大的潛力。總體而言，本研究成功開發(fā)了一種適用于吸濕性食品的快速微生物檢測技術，能夠顯著縮短檢測時間，提高檢測效率和準確性。未來，該技術有望在食品工業(yè)中得到廣泛應用，尤其是在需要快速評估微生物質量的場景中。然而，該技術在工業(yè)環(huán)境中的可重復性和操作簡便性仍需進一步驗證，以確保其在實際應用中的可靠性和穩(wěn)定性。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應用
將3D光學顯微鏡掃描系統(tǒng)oCelloScope置于培養(yǎng)箱（35°C）中，并將裝有準備好的微型瓊脂板的6孔板加載到系統(tǒng)中，以使用IntuGrow軟件（Biosense Solution，丹麥）進行延時圖像生長分析。按照先前報道的研究）經(jīng)過一些修改。簡而言之，在20 h內每小時生成每個孔的5670張圖像。應用的技術設置為2 ms的照明時間、1.4 mm×1.05 mm的視場（FOV），聚焦深度為10μm，光學分辨率為1.35μm，光學放大倍數(shù)為4.0。成像從下方進行，由于各種角叉菜膠類型的吸濕能力，與在瓊脂頂部觀察到的不規(guī)則和變化的瓊脂高度相比，在微型瓊脂平板內獲得了瓊脂更平坦和光滑的一面。傾斜的（相對于水平面6.25°）光軸可以掃描微型瓊脂板并形成圖像堆棧。單個z平面的投影z堆棧圖像是通過組合傾斜圖像生成的。
實驗結論
使用了光學延時顯微鏡技術（IntuGrow）在快速評估吸濕性食品（如卡拉膠）中的微生物質量方面具有顯著潛力。與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比，該技術能夠將檢測時間從72小時縮短至12-20小時，大大提高了檢測效率。Deming回歸分析顯示，光學延時顯微鏡法與傳統(tǒng)平板計數(shù)法之間存在幾乎完美的相關性（斜率為0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差，表明傳統(tǒng)平板計數(shù)法可能高估了微生物數(shù)量，而IntuGrow技術可能低估了微生物數(shù)量。這種偏差可能與卡拉膠的特性（如膨脹和抑制微生物生長）以及兩種方法的樣品制備方式有關。盡管IntuGrow技術在檢測限（50 CFU/g）上略高于傳統(tǒng)平板計數(shù)法（40 CFU/g），但其快速檢測的優(yōu)勢使其在工業(yè)應用中具有明顯吸引力，尤其是在需要快速釋放產(chǎn)品以減少召回風險和提高食品安全性的情況下。此外該技術通過“夾心法”樣品制備和DELAY算法，成功解決了卡拉膠膨脹和背景噪聲的問題，能夠有效區(qū)分微生物微菌落和卡拉膠引起的假陽性信號。
圖1、均勻100×稀釋的角叉菜膠樣品的瓊脂接種問題。A/B：角叉菜膠形成凝膠狀結構和氣泡，可能會被誤解并算作菌落。這些通常存在于培養(yǎng)皿底部附近，而菌落則出現(xiàn)在瓊脂的整個瓊脂中。C/D：角叉菜膠會產(chǎn)生渾濁和渾濁的背景以及帶有小顆粒和氣泡的干擾結構，在早期孵育（24-48小時）和計數(shù)（72小時）期間，根據(jù)樣品微生物群的不同，這些小顆粒和氣泡可能會被誤認為是小菌落。E/F：在5%的瓊脂平板中觀察到芽孢桿菌屬的蜂群菌落，這使得這些平板無法計數(shù)或具有挑戰(zhàn)性。
圖2、使用Biosense微生物動態(tài)堿性系統(tǒng)的IntuGrow DELAY算法處理原始顯微鏡圖像之前（A）和（B）之前（B）基于圖像的微生物微菌落計數(shù)。微生物微菌落（用黃色圓圈標記的示例）在處理后的圖片中顯示為黑點，其中基于延時處理的DELAY算法將未生長的角叉菜膠碎片和氣泡作為白點或灰色隕石坑（示例用紅色虛線圓圈標記）。
圖3、Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)基于圖像的微生物計數(shù)允許在芽孢桿菌屬蜂群開始覆蓋其他菌落之前對微生物菌落進行計數(shù)。黃色圓圈表示菌落，由于蜂群，使用傳統(tǒng)的終點計數(shù)不會對其進行計數(shù)。
圖4、在IntuGrow處理（D、E、F）具有高、中和低微生物污染水平（從左到右）的原始圖像（A、B、C）后，對角叉菜膠樣品進行基于圖像的計數(shù)。檢測到的CFU數(shù)量和計算的CFU/g濃度如圖D、E和F所示。
圖5、14個角叉菜膠樣品的細胞濃度（log CFU/g）比較。對原始商業(yè)角叉菜膠樣品（A、B、C、D、E、F）以及通過角叉菜膠樣品稀釋（/稀釋因子）或加標（s）獲得的微生物濃度降低或增加的樣品進行了測試。所有樣品均在獨立測試中進行了兩次重復測試。A）所有測試的角叉菜膠樣品和重復中的細胞濃度。B）為每種角叉菜膠類型獲得的平均細胞濃度的Demings回歸，具有完美的（x=y）相關線以進行視覺比較。C）比較IntuGrow和平板計數(shù)時平均CFU濃度的殘差圖。
總結
在食品行業(yè)，獲得結果的時間對于更快地放行產(chǎn)品、最大限度地減少召回、緩解微生物污染問題以及最終實現(xiàn)食品安全至關重要。角叉菜膠是從紅海藻（Rhodophyta）中分離出來的，由于其吸濕特性，它被用作各種食品和飲料中的膠凝劑、增稠劑、紋理劑或穩(wěn)定劑。目前，標準的行業(yè)平板計數(shù)方法需要在與熔融瓊脂混合之前將樣品稀釋100倍，以便在企業(yè)對企業(yè)運輸之前評估角叉菜膠樣品中的微生物污染水平。然而，即使在這種稀釋下，角叉菜膠也會膨脹、形成團塊、堵塞移液器，并在瓊脂平板上留下厚厚的凝膠結構、氣泡和碎屑，導致微生物計數(shù)具有挑戰(zhàn)性并容易出現(xiàn)人為錯誤。
在這里，研究人員首次報道了由Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)內的IntuGrow解決方案監(jiān)測的微型瓊脂板的應用，以評估具有挑戰(zhàn)性的食品成分中的微生物質量。在不稀釋食品樣品的情況下，將角叉菜膠粉末撒在兩層平板計數(shù)瓊脂之間，以在12-20小時內對細菌進行計數(shù)，而通過傳統(tǒng)平板計數(shù)進行計數(shù)需要72小時。開發(fā)了一種用于光學延時顯微鏡（ocelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）的DELAY算法，并將其添加到IntuGrow分析軟件中，以通過使用以前的圖像對背景進行歸一化來抑制腫脹的影響并增強對生長微生物菌落存在的檢測。延時顯微鏡基于圖像的監(jiān)測可以從角叉菜膠樣品中獲得結果，而由于細菌成群結隊，傳統(tǒng)平板計數(shù)無法獲得的結果。
兩種方法之間的比較顯示0.96的近乎完美的Demings斜率，而觀察到的-0.33 log CFU/g偏差表明IntuGrow計數(shù)低于傳統(tǒng)平板計數(shù)。這可能是由于卡拉膠人工制品在后一個板塊中被算作菌落。IntuGrow能夠對角叉菜膠等具有挑戰(zhàn)性的食品成分中的細菌進行計數(shù)，這意味著該技術應該易于應用于易于稀釋的樣品或非親水膠體粉末。光學延時顯微鏡技術（Biosense微生物動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)）在快速評估吸濕性食品中的微生物質量方面表現(xiàn)出色，未來有望在食品工業(yè)中得到廣泛應用。其快速檢測能力不僅能夠提高生產(chǎn)效率，還能為食品安全管理提供更及時的決策支持。
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