發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒構(gòu)建燈盞花發(fā)根最優(yōu)的培養(yǎng)體系（三）
2.2菌液濃度對發(fā)根誘導(dǎo)率的影響
在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液濃度是否適當(dāng)是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵問題之一。若菌液濃度過低，可能會使農(nóng)桿菌無法有效侵染葉盤而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率過低；若菌液濃度過高，則可能造成侵染過度或菌體產(chǎn)生代謝物對植物細(xì)胞造成傷害而導(dǎo)致葉盤死亡。此外，如果濃度過高，可能使農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上也會生長過旺，導(dǎo)致后續(xù)的脫菌培養(yǎng)無法進(jìn)行。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度的OD600值為0.4時，誘導(dǎo)率普遍較低，甚至未能成功誘導(dǎo)出陽性發(fā)根；菌液濃度在OD600值為0.8時雖然轉(zhuǎn)化率較高，但外植體死亡率或染菌率也高，發(fā)根后續(xù)脫菌培養(yǎng)過程難以抑制農(nóng)桿菌生長，造成無法液培。而OD600為0.6時，整體上誘導(dǎo)率相對較高，外植體死亡率較低，且基本不影響后續(xù)的脫菌培養(yǎng)及液培。因此綜合取OD600=0.6為最佳菌液濃度。
2.3浸染時間對發(fā)根誘導(dǎo)率的影響
農(nóng)桿菌菌液浸染葉盤的時間對轉(zhuǎn)化率有很大影響。若浸染時間太短，可能農(nóng)桿菌未能成功侵入葉盤細(xì)胞而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失??；若浸染時間太長，則農(nóng)桿菌容易對葉盤造成過度傷害而使葉盤黃化死亡。
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度較低時，浸染時間越長，則整體上誘導(dǎo)率越高，但葉盤死亡率或染菌率也隨之增高；菌液濃度較高時，浸染時間在10 min以內(nèi)，誘導(dǎo)率隨浸染時間的增加而整體呈增加的趨勢，但浸染時間達(dá)15 min時，則因葉盤大量黃化死亡而導(dǎo)致誘導(dǎo)率直線下降。因此，綜合取浸染時間為10 min最佳。
2.4共培養(yǎng)時間對發(fā)根誘導(dǎo)率的影響
浸染后共培養(yǎng)的目的，是使葉盤表面的農(nóng)桿菌充分侵入細(xì)胞。因此，共培養(yǎng)時間也是影響誘導(dǎo)率的重要因素。試驗(yàn)表明，菌液濃度較低，浸染時間較短時，0～3 d內(nèi)，共培養(yǎng)時間越長，誘導(dǎo)率基本就越高，但同樣存在隨共培養(yǎng)時間增加，葉盤死亡率和染菌率也增高的問題；而菌液濃度較高，浸染時間較長時，共培養(yǎng)時間在0～2 d時，誘導(dǎo)率整體呈增長趨勢，但超過2 d，則轉(zhuǎn)化率不會再顯著升高，甚至反而會因?yàn)檫^度生長的農(nóng)桿菌抑制植物細(xì)胞的正常生長，造成葉盤死亡率急劇升高，或者因脫菌不完全而導(dǎo)致無法液培。因此，共培養(yǎng)時間以2 d為最好。
2.5不同液體培養(yǎng)基對發(fā)根生長速率的影響
發(fā)根脫菌完全后，轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在上述4種不同的液體培養(yǎng)基中，發(fā)根生長速率不同，總體上是B5>1/2MS≈1/2B5>MS。在含200 mL B5液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，發(fā)根整個生長周期為60～70 d，其中前3周，發(fā)根生長速率極慢，基本看不到明顯的生長現(xiàn)象，第4周開始表現(xiàn)出較快的生長速率，在第5～7周生長速率達(dá)到最快，在第8～9周以后生長基本進(jìn)入停滯期，10周之后發(fā)根開始變硬，部分根尖開始褐化。不同培養(yǎng)基生長速率比較如圖3。
圖3發(fā)根在不同培養(yǎng)基中生長速率
3結(jié)論與討論
本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1菌株侵染燈盞花葉片，成功誘導(dǎo)出毛狀根。同時，通過對菌液濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間3個影響因素的試驗(yàn)，優(yōu)化了燈盞花發(fā)根的誘導(dǎo)條件。
結(jié)果顯示農(nóng)桿菌菌液濃度直接影響發(fā)根誘導(dǎo)效率，燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)的最佳菌液濃度為OD600=0.6，李景濱等的研究發(fā)現(xiàn)，金鐵鎖(Psammosilenetunicoides)毛狀根誘導(dǎo)的最佳菌液濃度為OD600=0.8；農(nóng)桿菌對葉盤的浸染時間是遺傳轉(zhuǎn)化中的重要因素，燈盞花最佳浸染時間為10 min，黃偉劍等的研究表明，廣藿香(Pogostemoncablin)毛狀根誘導(dǎo)的最佳浸染時間為25 min；共培養(yǎng)時間的長短也與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)，適于燈盞花發(fā)根誘導(dǎo)的共培養(yǎng)時間為2 d，劉連旺等的研究顯示，適于地黃(Rehmanniaglutinosa)毛狀根誘導(dǎo)的最佳共培養(yǎng)時間為4 d。由此可見不同植物對農(nóng)桿菌敏感性不同，因此選擇合適的菌液濃度、浸染時間和共培養(yǎng)時間有助于提高誘導(dǎo)率。另外，燈盞花發(fā)根擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為B5液體培養(yǎng)基。
本研究初步建立了燈盞花發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化體系。隨著對植物中次生代謝途徑了解的深入，基因克隆和高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展，利用遺傳代謝工程手段在植物細(xì)胞工廠大量生產(chǎn)有藥理活性的次生代謝化合物已成為可能。如果將燈盞花中燈盞乙素代謝途徑中催化速率限制步驟的關(guān)鍵酶基因采用代謝工程的方法在燈盞花植物體或發(fā)根中過量表達(dá)，則理論上也可以提高燈盞乙素的含量。
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