327株不同種類鏈球菌的體外藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法（一）
鏈球菌是臨床能夠分離到的常見(jiàn)致病菌之一，尤其是肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌等，對(duì)于人類，尤其是兒童的健康存在巨大威脅。隨著目前廣譜抗菌藥物在臨床中的應(yīng)用日益增多，臨床上鏈球菌對(duì)于某些抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴(yán)重。因此，臨床分離鏈球菌屬的體外藥敏試驗(yàn)檢測(cè)顯得尤為重要。目前，臨床上已經(jīng)有商業(yè)化的鏈球菌藥敏檢測(cè)試劑，并且已得到較為普遍的應(yīng)用，但是不同廠家或不同方法學(xué)之間存在較大差異。本文通過(guò)考察一種國(guó)產(chǎn)商業(yè)化鏈球菌藥敏板與微量肉湯稀釋法對(duì)327株不同種類鏈球菌的體外藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，進(jìn)而評(píng)估該新型商業(yè)化鏈球菌藥敏板卡的體外藥敏檢測(cè)性能，以期為臨床鏈球菌屬引起的感染性疾病提供更合理的用藥指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1材料
收集2018-2019年來(lái)源于鄭州市中心醫(yī)院、鄭州市人民醫(yī)院、南陽(yáng)市中心醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院的327株鏈球菌屬臨床菌株，包括肺炎鏈球菌107株，化膿鏈球菌41株，緩癥鏈球菌51株，無(wú)乳鏈球菌55株，停乳鏈球菌7株，星座鏈球菌13株，咽頰炎鏈球菌15株，草綠色鏈球菌8株，中間鏈球菌22株，血鏈球菌8株。標(biāo)準(zhǔn)菌株：肺炎鏈球菌(ATCC49619)。
1.2儀器與試劑
上海精科科技公司的酸度計(jì)，廈門致微公司的高壓滅菌鍋，瑞士METTLER TOLEDO公司的電子天平，金壇市科析儀器公司的振蕩儀，上海躍進(jìn)公司的恒溫培養(yǎng)箱，法國(guó)生物梅里埃公司的比濁儀，美國(guó)SIGMA公司的快速離心機(jī)，中國(guó)海爾集團(tuán)的-20 ℃冰箱，美國(guó)Thermo公司的移液器，美侖生物科技公司的頭孢曲松、利福平、氨芐西林、頭孢呋辛、美羅培南、青霉素、氯霉素、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、四環(huán)素、利奈唑胺、替加環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、甲氧芐啶、復(fù)方磺胺甲噁唑、萬(wàn)古霉素、紅霉素抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自O(shè)xoid公司的M-H干粉、脫纖維綿羊血、礦物油，血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，鏈球菌藥敏檢測(cè)試劑盒(比色/比濁法，鄭州安圖生物工程股份有限公司)，洛陽(yáng)昊華公司的無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)公司的二甲基亞砜。
1.3方法
使用血瓊脂平板對(duì)質(zhì)控菌株和臨床菌株進(jìn)行活化，利用0.85%生理鹽水將各臨床菌株制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海鶕?jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)《需氧菌的稀釋法藥敏試驗(yàn)方法》關(guān)于鏈球菌屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基制備的規(guī)定，將M-H干粉按照要求的量充分溶解并調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，121 ℃高溫高壓滅菌15 min，滅菌的M-H肉湯冷卻后，添加2.5%～5.0%的脫纖維綿羊血，混勻后備用。分別稱取頭孢噻肟等20種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要考核試劑的各種抗菌藥物濃度分布及CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于肉湯稀釋法操作過(guò)程的嚴(yán)格規(guī)定，使用合適的溶解試劑進(jìn)行抗菌藥物的溶解并加入96孔板內(nèi)，每孔加入10 μL的10倍于檢測(cè)濃度的抗菌藥物溶解液，并使用大型真空干燥箱進(jìn)行快速干燥處理，保存?zhèn)溆谩?
微量肉湯稀釋法操作：取90 μL加血M-H肉湯加入96孔酶標(biāo)板，將板立即置于Bioscreen C自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)上。；每種抗菌藥物進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，將已制得的0.5麥?zhǔn)蠁挝毁|(zhì)控菌懸液稀釋200倍后，各取10 μL加入酶標(biāo)板各孔內(nèi)，滴加1滴礦物油液封并置于35～37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待評(píng)價(jià)鏈球菌藥敏試劑盒操作過(guò)程：取出1瓶培養(yǎng)液，向其中添加1滴顯色液和100 μL菌懸液，混勻后向120孔鏈球菌藥敏板每孔加入100 μL菌懸液，滴加礦物油后蓋上蓋子置于35～37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。兩種操作均要求首先進(jìn)行肺炎鏈球菌(ATCC49619)的質(zhì)控，合格后才能進(jìn)行臨床菌株試驗(yàn)。依據(jù)CLSI文件M100-S29標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和敏感性結(jié)果進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)分析。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
對(duì)兩種方法所測(cè)得的最小抑菌濃度(MIC)結(jié)果及菌株敏感性結(jié)果按照菌株分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)CLSI的M52標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株敏感性比較分析；統(tǒng)計(jì)出3種方法的基本一致性(EA，即不同MIC測(cè)定方法在±1個(gè)稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的結(jié)果一致性)和分類一致性(CA，即不同方法測(cè)定的菌株對(duì)抗菌藥物敏感性的一致性)，另外，對(duì)于菌株敏感性，需要進(jìn)行非常重大誤差(VME，即耐藥誤判為敏感)、重大誤差(ME，即敏感誤判為耐藥)和微小誤差(mE，即中介報(bào)告為敏感或耐藥)結(jié)果的測(cè)定。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定指出，CA≥90%、EA≥90%、VME≤1.50%、ME≤3.00%、mE<3.00%為可接受范圍。
2 結(jié) 果
2.1考核試劑盒與微量肉湯稀釋法EA測(cè)定結(jié)果
統(tǒng)計(jì)鏈球菌藥敏試劑盒與微量肉湯稀釋法的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)其EA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于不同方法學(xué)結(jié)果差異的規(guī)定，不同測(cè)定方法的MIC差值≤1個(gè)倍比梯度認(rèn)為是正確測(cè)定值。EA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法共測(cè)定327株鏈球菌的體外藥敏檢測(cè)，在EA方面，按照測(cè)試結(jié)果總量統(tǒng)計(jì)，新型鏈球菌藥敏板與微量肉湯稀釋結(jié)果差異在±1個(gè)稀釋倍數(shù)內(nèi)的整體符合結(jié)果個(gè)數(shù)/總結(jié)果個(gè)數(shù)為6 509/6 540，整體EA為99.53%。對(duì)于所涵蓋的抗菌藥物種類：頭孢曲松、利福平、頭孢呋辛、青霉素、氯霉素、頭孢噻肟、阿莫西林/克拉維酸、頭孢吡肟、四環(huán)素、利奈唑胺、替加環(huán)素、左氧氟沙星、克林霉素、莫西沙星、萬(wàn)古霉素、紅霉素的EA均為100.00%；氨芐西林EA為97.86%；美羅培南EA為96.94%；復(fù)方磺胺甲噁唑EA為97.55%；紅霉素/克林霉素誘導(dǎo)試驗(yàn)EA為98.17%；對(duì)于所測(cè)臨床菌株，隨機(jī)選取10株進(jìn)行結(jié)果重復(fù)性測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果與已測(cè)結(jié)果一致。
表1 考核試劑盒與微量肉湯稀釋法EA測(cè)定結(jié)果
2.2考核試劑盒與微量肉湯稀釋法CA測(cè)定結(jié)果
對(duì)兩種測(cè)定方法的體外藥敏檢測(cè)的CA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法測(cè)定共進(jìn)行327株鏈球菌的體外藥敏檢測(cè)，兩種方法的整體CA為97.40%，VME為0.09%，ME為0.59%，mE為1.92%。新型鏈球菌藥敏板與“金標(biāo)準(zhǔn)”微量肉湯稀釋法的CA測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。
表2 考核試劑盒與微量肉湯稀釋法CA測(cè)定結(jié)果[n(%)]
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