適用于低鹽發酵香腸葡萄球菌與乳酸菌生長特性及產酸能力測定及篩選（二）
1.3方法
1.3.1菌株分離與純化
無菌操作下稱取10 g絞碎的樣品，轉移至100 mL無菌生理鹽水中，振蕩（200 r/m，30 min）混勻；靜置數分鐘，再取1 mL加入到9 mL無菌生理鹽水中，即成10-2稀釋度，根據需要再依次稀釋；選取合適稀釋度的樣品溶液，倒入相應的固體培養基中，混勻后37℃靜置培養24～48 h；挑取單菌落反復劃線，直至獲得純的菌株。其中，乳酸菌的分離采用含有3%CaCO3的MRS固體培養基，挑取具有溶鈣圈的菌株；葡萄球菌的分離采用MSA固體培養基。
1.3.2菌株的初步篩選
對純化后的菌株進行革蘭氏染色、菌體形態觀察，選擇革蘭氏陽性菌種保存。對所分離的革蘭氏陽性菌分別進行如下篩選：
接觸酶實驗：將37℃培養過夜后的菌液用接種環涂抹于已滴有5%H2O2的玻片上，立即觀察結果，3 min內出現氣泡者為陽性反應，反之為陰性。
耐硝性實驗：以1%的接種量將菌種分別接種于不同亞硝酸鈉添加量（0、50、100、150 mg/kg）的液體培養基中，37℃培養48 h，于600 nm波長處測定吸光度。
產酸能力測定：以1%接種量將菌株接種于液體培養基中，37℃培養24、48 h后測定發酵液的pH值。
對于所分離的陽性球菌菌株，分別進行如下額外指標的篩選：
耐酸性實驗：以1%的接種量將菌種分別接種于NB液體培養基（pH值調至5.0）中，37℃培養48 h，于600 nm波長處測定吸光度。
溶血實驗：用接種針取37℃培養過夜后的菌液，在血平板上劃線，37℃培養24、48、72 h后觀察結果，有溶血圈出現的菌株為陽性，以金黃色葡萄球菌作為陽性對照。
硝酸鹽還原酶活力測定：檢查37℃培養過夜后菌液的硝酸鹽還原情況，在白色搪瓷比色盤中加入1滴菌液，然后加入硝酸還原試劑A、B液各1滴，觀察菌落周圍出現的紅圈大小和清晰度，顯色反應后，挑出紅圈直徑＞1.2 cm的菌株。
1.3.3菌株的復篩
對初步篩選所得到的葡萄球菌及乳酸菌菌株進行進一步的篩選：
蛋白酶活性檢測：將37℃培養過夜后的新鮮菌液分別點接種在脫脂牛乳平板培養基（SM）上，培養5 d。觀察菌落周圍透明圈的大小。
氨基酸脫羧酶實驗：將37℃培養過夜后的菌液傾注到氨基酸脫羧酶檢測培養基（分別含有0.5%酪氨酸、0.25%組氨酸、賴氨酸及精氨酸，以不添加氨基酸作為空白對照）中，37℃培養，變色則為陽性。
精氨酸雙水解酶實驗：將37℃培養過夜后的菌液傾注到精氨酸雙水解酶檢測培養基（含有1%L-精氨酸鹽）中，37℃培養，培養基轉化為紅色者為陽性。
對于初步篩選得到的葡萄球菌菌株，分別進行如下額外指標的篩選：
脂肪酶活性檢測：將37℃培養過夜后的新鮮菌液分別點接種在三丁酸甘油酯培養基（TB）上，培養5 d，觀察菌落周圍透明圈。
乙偶姻產生實驗：接種葡萄球菌菌株于乙偶姻檢測培養基，取培養液和40%NaOH等量混合。加少許肌酸，如果培養液10 min出現紅色即為陽性反應。
對于所分離的乳酸菌菌株，進行抑菌實驗作為額外的篩選指標：將乳酸菌菌株培養至約為108CFU/mL，點接種于已含有106CFU/mL的敏感指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以及蠟樣芽孢桿菌）的固體平板上，37℃培養12 h，觀察菌落周圍是否存在抑菌圈。
1.3.4菌株的分類學鑒定
形態學觀察：將菌株平板劃線于固體培養基上，觀察菌落形態，挑取對數生長期的菌體進行革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌體細胞形態。
生理生化實驗：參照《乳酸細菌現代研究實驗技術》及《常見細菌系統鑒定手冊》對篩選菌株的生理生化特性進行檢測，包括精氨酸雙水解酶實驗、糖醇發酵實驗等。
16S rDNA分子生物學鑒定：細菌基因組DNA按照試劑盒說明書步驟進行提取。以提取基因組作為PCR擴增的模板，利用通用引物Lpw57（5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）及Lpw205（5’-CTT GTT ACG ACT TCA CCC-3’）進行PCR擴增。PCR反應體系（25μL）為：10×Buffer 2.5μL、模板DNA 1μL、引物各2.5μL、dNTP 2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、dd H2O 14.25μL，混勻5 min。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃1 min、43℃30 s、72℃90 s，進行30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖電泳分析后由北京諾賽基因組研究中心測序。
系統發育樹的構建：所得菌株序列根據NCBI網站的BLAST程序在GenBank數據庫中進行比對鑒定，根據鑒定結果及相似性較高的幾株菌的16S rRNA，利用MEGA軟件進行菌株系統發育樹的構建。
1.3.5菌株的生長特性及產酸能力測定
將菌株接種于相應的液體培養基，37℃培養（葡萄球菌接種在NB液體培養基中200 r/min振蕩培養，乳酸菌接種在MRS液體培養基中靜置培養），以液體培養基為空白對照，每2 h用紫外分光光度計于600 nm波長處測定吸光度，用酸度計測定菌液的pH值。
1.3.6菌株間拮抗性測試
用含乳酸菌的接種環，在低鹽模擬肉湯固體培養基（NaCl質量分數2%）上劃一直線接菌。37℃條件下培養48 h，待形成菌落后，沿菌落邊緣（不接觸）用接種環從垂直方向接種葡萄球菌；37℃條件下培養24 h，觀察乳酸菌對于葡萄球菌的抑制效果。
1.4數據處理
所有實驗均重復進行3次，使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計和方差分析，使用Excel軟件對數據進行分析及作圖。
相關新聞推薦
1、釀造產香魯氏接合酵母耐溫、耐鹽的營養需求特點與逆境響應差異
2、細菌懸液中活菌濃度的檢測方法：平板點樣技術VS傳統平板涂布法
3、肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質影響——結果與分析