可同化氮類型對(duì)桑葚酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量、乙醇含量的影響（一）
桑葚含有糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)元素和多糖、黃酮、花色苷、生物堿等多種功能活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。成熟桑葚質(zhì)地柔嫩，不耐貯運(yùn)，易腐爛變質(zhì)，難以滿足市場(chǎng)需求。近年來果桑發(fā)展迅速，果實(shí)采摘、銷售不及時(shí)造成大量損失。將桑葚進(jìn)行加工是提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有效方法，常見的加工產(chǎn)品有果酒、果汁、果醬等。桑葚酒保留桑葚果實(shí)中黃酮、多酚、花色苷、生物堿等生物活性物質(zhì)，受到廣泛關(guān)注。生產(chǎn)中提高桑葚酒發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時(shí)間，從而提高設(shè)備利用率，加快桑葚處理速度，可以有效緩解桑葚不易貯藏的難題。發(fā)酵過程中菌種選擇和繁殖條件都可以影響發(fā)酵速度。
酵母菌在釀酒過程中利用糖、氨基酸、無機(jī)鹽、有機(jī)酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和代謝，將糖轉(zhuǎn)化成乙醇。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中氮元素是關(guān)鍵物質(zhì)之一，酵母菌能夠直接利用的氮主要有游離α-氨基酸態(tài)氮、小分子肽和游離銨離子，稱為酵母可同化氮。研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵過程中添加可同化氮可以顯著提高葡萄酒發(fā)酵速度和乙醇產(chǎn)量。添加可同化氮對(duì)葡萄酒發(fā)酵影響的研究較多，桑葚釀酒過程中添加可同化氮也有相關(guān)報(bào)道，但添加可同化氮對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響尚未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。試驗(yàn)以桑葚原漿為原料，通過添加不同類型氮源提高可同化氮含量，測(cè)定發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)，研究可同化氮類型對(duì)桑葚酒發(fā)酵的影響，為桑葚酒生產(chǎn)中補(bǔ)加可同化氮提供參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
桑葚原漿（5月份采摘新鮮成熟桑葚，采摘后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃保存）；釀酒酵母（活性干酵母，La Bayanus，法國(guó)Oenofrance公司）。
果膠酶、偏重亞硫酸鉀、山梨酸鉀（煙臺(tái)帝伯仕有限公司）。
1.2儀器與設(shè)備
可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；μCount3D微生物立體計(jì)數(shù)儀（丹麥Biosense公司）；pH計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）；破壁機(jī)（山東九陽(yáng)小家電有限公司）；GC7900氣相色譜儀（天美科技有限公司）；50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國(guó)Supelco公司）；7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS，安捷倫科技有限公司）。
1.3試驗(yàn)方法
桑葚酒釀造工藝流程：桑葚解凍、去梗、清洗、晾干，破壁機(jī)打漿，桑葚原漿按照13 g/100 g添加蔗糖，按照120 mg/kg和30 mg/kg分別加入偏重亞硫酸鉀和果膠酶，按照0.02%接種活性干酵母。將勻漿分裝到15個(gè)1 L三角瓶中，每瓶裝500 g處理后的桑葚原漿。三角瓶用棉塞封口，發(fā)酵溫度為21℃，還原糖含量基本保持不變時(shí)，加入320 mg/kg偏重亞硫酸鉀和200 mg/kg的山梨酸終止發(fā)酵。
試驗(yàn)設(shè)添加硫酸銨、谷氨酸、色氨酸、丙氨酸、不添加（CK）5個(gè)處理，可同化氮添加量為150 mg N/kg。
1.4測(cè)定方法
發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量采用CFU/mL測(cè)定法，還原糖含量采用DNS法，可同化氮含量采用甲醛值法。
乙醇含量采用氣相色譜法，乙醇含量測(cè)定采用ZKAT FFAP（30 m×0.25 mm×0.25μm）毛細(xì)管色譜柱。載氣為氮?dú)猓髁? mL/min，空氣流量380 mL/min，氫氣流量30 mL/min。色譜柱初溫45℃，保持5 min，以5℃/min升至50℃，保持5 min，以20℃/min升至230℃，保持2 min；分流比25︰1，進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID溫度280℃，尾吹氣氮?dú)饬髁?0 mL/min，進(jìn)樣量1μL。
樣品中高級(jí)醇包括異丙醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、β-苯乙醇，采用頂空固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-GC-MS）進(jìn)行測(cè)定，參考李智慧等的方法，略有改動(dòng)。處理?xiàng)l件：向20 mL頂空瓶中加入20μL 210 mg/L的2-辛醇內(nèi)標(biāo)、3 g NaCl、轉(zhuǎn)子和10 mL發(fā)酵液，使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，用PTFE墊密封，并置于磁力攪拌器上，在350 r/min條件下攪拌，在45℃下預(yù)熱10 min，吸附30 min。250℃解吸4 min，用于GC-MS測(cè)定。
氣相色譜條件：安捷倫GC7890B氣相色譜儀，安捷倫DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）。色譜柱初溫40℃，保持2 min，以6℃/min升至230℃，穩(wěn)定1 min，以20℃/min升至230℃，穩(wěn)定2 min；載氣為氦氣，不分流。
質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；檢測(cè)器溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30~400。
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