基于超微藥粉瓊脂稀釋法檢測9種致病菌對常用15種中藥的敏感性（一）
細(xì)菌性傳染病是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的主要疾病之一，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害最嚴(yán)重，常導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類的大量死亡，造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。致病菌對抗菌藥物的耐藥性程度和頻率越來越高，篩選高效的抗菌藥物仍然是治療細(xì)菌性傳染病的最主要方法。在測試致病性細(xì)菌對某一藥物的敏感性時，常用的方法有濾紙片法、牛津杯法、試管二倍稀釋法、平板二倍稀釋法。目前，這四種檢測方法存在操作繁瑣、工作量大、周期長、培養(yǎng)條件不一致等問題，不能快速地確定致病菌株對各藥物的敏感性。尤其在初步篩選抗菌中藥時，植物藥材種類繁多，每種藥材預(yù)先要粗提其有效部位，并去除萃取溶劑，操作程序更復(fù)雜、耗時更長。
本研究目的是為了建立針對多株致病菌可同步進(jìn)行初篩抗菌中藥的一種快速簡便的藥敏實驗方法。首先利用超微粉碎機(jī)將15種植物藥材粉碎成微米級顆粒（5～10μm），可提高藥材中抑菌成分的有效溶出；隨后將超微藥粉添加到M-H營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)制成系列藥物濃度的固體平板，再接種9株致病菌于同一瓊脂平板上進(jìn)行藥敏實驗，24 h培養(yǎng)后觀察供試菌的菌落生長情況，以無菌落形成的最低濃度為該中藥的最低抑菌濃度（MIC），該方法定名為超微藥粉瓊脂稀釋法。
1材料和方法
1.1藥材與試劑
五倍子（Galla Chinensis，縮寫GC，產(chǎn)地湖北）；石榴皮（Pomegranate Rind，縮寫PR，產(chǎn)地安徽）；大黃（RhubarbOfficinale，縮寫RO，產(chǎn)地甘肅）；黃芩（Baical Skullcap Root，縮寫B(tài)SR，產(chǎn)地河北）；虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati，縮寫RPC，產(chǎn)地福建）；黃連（Golden Thread，縮寫GT，產(chǎn)地四川）；連翹（Weeping Forsythia Capsule，縮寫WFC，產(chǎn)地江西）；知母（Common Anemarrhena Rhizome，縮寫CAR，產(chǎn)地河北）；首烏藤（Caulis Polygoni Multiflori，縮寫CPM，產(chǎn)地江蘇）；地榆（Radix Sanguisorbae，縮寫RS，產(chǎn)地福建）；貫眾（Dryopteris Setosa，縮寫DS，產(chǎn)地四川）；金銀花（Flos Lonicerae，縮寫FL，產(chǎn)地遼寧）；紫花地丁（Purpleflower Violet，縮寫PV，產(chǎn)地河南）；馬齒莧（Portulaca Oleracea Linn，縮寫POL，產(chǎn)地福建）；苦楝皮（Cortex Meliae，縮寫CM，產(chǎn)地四川），均購自國藥控股福建有限公司；標(biāo)準(zhǔn)肉湯培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Broth，M-H），購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.2菌株
9株魚類致病菌均為本研究室從漳浦、莆田、龍巖、福清等養(yǎng)殖場病鰻中分離得到，并經(jīng)人工感染實驗證實為致病菌，同時菌株進(jìn)行生理生化和基因鑒定，分別確定為氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）B01、B19、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）B14、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）B10、B15、B18、B20、B27、腸棕氣單胞菌（Aeromonas enteropelgenes）B09。
1.3菌懸液制備
從保種斜面上挑取菌苔劃線接種M-H瓊脂（Mueller-Hinton Agar）平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h；挑取單個菌落劃線至新鮮斜面上，28℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來，采用酶標(biāo)儀測定菌液濃度，測定波長為600 nm。采用菌落計數(shù)法確定細(xì)菌密度與吸光度OD600的關(guān)系數(shù)，不同菌株的菌液OD600值約為0.2～0.3時，對應(yīng)活菌計數(shù)值約為108CFU/ml，將菌液濃度稀釋10倍調(diào)至107CFU/ml，即可作為藥敏實驗接種的菌懸液。
1.4中藥高壓水提液的制備
稱取50 g的中藥超微粉，加蒸餾水300 ml置于20 kHz超聲處理40 min后，置于高壓滅菌鍋中煎煮（110℃、10 min，95℃、30 min）提取，然后用50 ml離心管分裝，用冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心10 min，取上清液，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.5超微藥粉或藥液瓊脂稀釋藥物敏感實驗
在M-H培養(yǎng)基添加超微粉碎的中藥粉末或者高壓水提的藥液，以濃度6 g/ml和1 g/ml開始進(jìn)行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基。取9種已稀釋好的107CFU/ml菌液各2μl點種在經(jīng)過121℃、20 min滅菌后的同一個藥敏培養(yǎng)基平板上，每個藥物濃度梯度做3組平行。將接種好的平板放置28℃培養(yǎng)，24 h后觀察供試菌的菌落生長情況，以無菌落形成的最低濃度為中藥的最低抑菌濃度（MIC）。
1.6紙片法的藥物敏感實驗
首先用無菌蒸餾水將高壓水提的藥液進(jìn)行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的實驗藥液；用打孔器將濾紙打成直徑為6 mm的圓紙片，經(jīng)121℃高壓滅菌30 min，將此無菌濾紙片分別浸入藥液中，充分浸泡6 h后，用無菌鑷子移至無菌試管中，再滴加50μl藥液放在37℃干燥箱中烘干制成飽和的藥敏紙片；取已配制成107CFU/ml的菌懸液100μl均勻涂布于90 mm瓊脂平板上，將飽和的藥敏紙片貼于瓊脂平板表面，每皿貼5片不同濃度藥敏紙片，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量其抑菌圈直徑。每個濃度的藥物平行重復(fù)測試3次，判斷致病菌對藥物的敏感度。
2結(jié)果
2.1超微藥粉瓊脂稀釋法測定中藥對致病菌的抑制作用
選常用15種中藥，采用本研究建立的超微藥粉瓊脂稀釋法，檢測9株不同種屬的致病菌對它們的敏感度，從中篩選出抗菌活性高的藥材，為今后進(jìn)一步研制抗菌漁藥提供參考（見表1）。從表1的實驗結(jié)果可見，五倍子的抑菌效果最佳，其次是首烏藤、地榆，再次為石榴皮、貫眾、大黃、黃芩、虎杖，其余中藥的抑菌效果極差。B01、B27對五倍子極度敏感，其余7株菌為高度敏感；除B19、B20對首烏藤顯示中度敏感外，其余7株菌均表現(xiàn)為高度敏感；B10對地榆顯示低度敏感，B01、B14、B27為中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均為高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27對石榴皮顯示中度敏感，僅B01、B09表現(xiàn)高度敏感，B10顯示低度敏感，而B14顯現(xiàn)不敏感；B20對貫眾不敏感，B09、B27顯示低度敏感，B10、B14、B15、B19顯示對貫眾中度敏感，B01、B18對貫眾顯示高度敏感；除B01、B10、B15對大黃中度敏感外，其余均為低度敏感；9株致病菌對黃芩均呈現(xiàn)低度敏感。9株致病菌對虎杖的敏感性差異很大，B01、B10、B14、B18表現(xiàn)為高度敏感，但除B01對苦楝皮和黃連均中度敏感外，其余菌株均不敏感。
表1超微藥粉瓊脂稀釋法測定各種中藥的最低抑菌濃度（mg/l）
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