丙酸鈣、山梨酸鉀對(duì)面包腐敗真菌的時(shí)間生長(zhǎng)的功效
烘焙產(chǎn)品是中等水分食品（約0.95 a w；pH 5.0-6.0），因此如果不添加控制策略（例如食品級(jí)防腐劑、氣調(diào)包裝和儲(chǔ)存以及使用保濕劑。隨著消費(fèi)者減少防腐劑使用的壓力，現(xiàn)在正在尋找替代的天然防腐劑。然而一些腐敗真菌已經(jīng)進(jìn)化為對(duì)現(xiàn)有使用的防腐劑更具耐受性。因此需要關(guān)于重要腐敗霉菌對(duì)此類發(fā)酵烘焙食品中使用的防腐劑的相對(duì)敏感性/抵抗力的更準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。大多數(shù)這些防腐劑被食品和藥物管理局(FDA)普遍認(rèn)為是安全的(GRAS)，這通常意味著它們可以用于控制原材料和成品中的微生物污染（Garcia-Garcia和Searle，2016年）。然而，一些報(bào)告表明對(duì)這些防腐劑存在耐受性。例如，P.roqueforti菌株被發(fā)現(xiàn)對(duì)面包中使用的推薦濃度的丙酸鈣(CP；3,000 ppm)具有抗性，并且被發(fā)現(xiàn)在處理過(guò)的面包基質(zhì)中生長(zhǎng)。
用于細(xì)菌和酵母研究的Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)也可以通過(guò)對(duì)液體肉湯培養(yǎng)基的細(xì)微修改用于絲狀菌生長(zhǎng)測(cè)定。這使得能夠快速篩選新化合物的功效、產(chǎn)霉菌毒素腐敗真菌的生長(zhǎng)生態(tài)和霉菌毒素產(chǎn)生，以及生物防治劑配方的比較。本研究的目的是檢查從明顯變質(zhì)的面包中分離出的三種不同真菌菌株（H.burtonii(HB17)、P.variotii(PV10)和P.roqueforti(PR06)]）的相對(duì)敏感性/耐受性。使用Bioscreen C檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定一系列濃度(0–128 mM)CP和山梨酸鉀(PS)對(duì)其時(shí)間生長(zhǎng)的功效。有助于比較這兩種防腐劑對(duì)(a)與溫度（25和30°C）、水分活度（a w,0.95,0.97)和pH(5.0,5.5)和(b)使用相對(duì)檢測(cè)時(shí)間(TTD)值來(lái)確定這三個(gè)物種中的哪一個(gè)可能對(duì)這兩種食品級(jí)防腐劑更敏感/更有彈性。
Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀用于量化不同濃度的防腐劑對(duì)微生物隨時(shí)間生長(zhǎng)的功效。在100孔微量滴定板中裝入200μl具有防腐處理?xiàng)l件（pH;a w）的半固體YES培養(yǎng)基，并用每種菌株的孢子懸浮液接種。使用600 nm波長(zhǎng)每20分鐘記錄一次光密度(OD)的時(shí)間變化，持續(xù)6天（8,640分鐘），因?yàn)樗c真菌生物量的變化直接相關(guān)，獲得相關(guān)微生物的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)分別是在25°C和30°C下進(jìn)行，每個(gè)處理重復(fù)5次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：利用快速濁度法測(cè)定系統(tǒng)(Bioscreen C)來(lái)檢查丙酸鈣(CP)和山梨酸鉀(PS)控制重要面包腐敗真菌生長(zhǎng)的時(shí)間效力。目的是比較三種重要的腐敗真菌Hyphophichia burtonii(HB17)、Paecilomyces variotii(PV11)和Penicillium roqueforti的菌株的時(shí)間增長(zhǎng)(PR06)從明顯模制的面包中分離到(a)不同濃度的CP和PS(0–128 mM)，(b)溫度(25°C,30°C)，(c)水分活度（a w；0.95，0.97)和(d)pH(5.0,5.5)。所有三個(gè)非生物因素，pH、a w和溫度以及防腐劑濃度都會(huì)影響所檢查物種的相對(duì)生長(zhǎng)。總的來(lái)說(shuō)，PS在抑制這三個(gè)物種的菌株生長(zhǎng)方面比CP更有效。此外，還比較了在相互作用的非生物因素下防腐劑功效的檢測(cè)時(shí)間(TTD)。Paecilomyces variotii(PV10)菌株對(duì)防腐劑的耐受性最強(qiáng)，兩種防腐劑的TTD值都最短。P.roqueforti在所有檢查的條件下，是最敏感的，具有最長(zhǎng)的TTD值。
圖1、在含有不同濃度的丙酸鈣(CP)和(C,D)山梨酸鉀(PS)的情況下，擬青霉菌(PV10)在(A,B)和山梨酸鉀(PS)的半固體酵母提取物蔗糖(YES)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線（0–128 mM)使用BioScreen(C)培養(yǎng)超過(guò)6天。每條曲線代表五次重復(fù)的平均值。
圖2、在(A)25°C和(B)30°C下，CP對(duì)Hyphophichia burtonii(HB17)生長(zhǎng)（8,640分鐘，6天）的影響。PS對(duì)生長(zhǎng)的影響分別顯示在(C)25°C和(D)30°C中。從圖中顯示了CP和PS在6天后對(duì)H.burtonii生長(zhǎng)的相對(duì)抑制作用。PS在控制(p<0.05)H.burtonii(HB17)生長(zhǎng)方面具有顯著的效果。對(duì)于CP，在25°C/pH 5.0和0.97 a w下，與相同濃度的其他處理相比，這種腐敗酵母更具彈性并且能夠有效生長(zhǎng)。6天后，測(cè)試的最高濃度在0.95 a w（OD 0.83和0.86，p<0.05）和25°C下具有良好的功效。對(duì)于PS，在25°C和30°C觀察到顯著的(p<0.05)抑制作用，在0.95 a w中檢測(cè)到的最高濃度（64和128 mM）處理（見(jiàn)圖1C、D）。在30°C時(shí)，有效抑制需要最高濃度(128 mM)。
圖3、HB17在(A)25°C和(B)在不同濃度CP存在下的檢測(cè)時(shí)間（TTD；OD=0.4 OD；6天）；對(duì)于PS在(C)25°C和(D)30°C。在25°C存在CP的情況下，H.burtonii(HB17)的TTD周期最長(zhǎng)。在0.97 a w處理中，在4和16 mM濃度下，這些時(shí)間>5.0天（圖3A）。在30°C下，最長(zhǎng)TTD值（p<0.05）在0.95 a w處獲得（圖3B）。對(duì)于PS，需要測(cè)試的最高防腐劑濃度(128 mM)才能有效控制30°C的生長(zhǎng)。
圖4、P.variotii(PV10)在(A)25°C和(B)在30°C在不同濃度的CP存在下的TTD（OD=0.4 OD；6天）；對(duì)于PS在(C)25°C和(D)30°C。P.variotii(PV10)菌株在25°C下耐受所有CP濃度。事實(shí)上，在30°C時(shí)，增加CP的濃度似乎會(huì)刺激生長(zhǎng)（圖4A、B）。然而，該菌株無(wú)法在pH 5.0和>32 mM PS下開(kāi)始生長(zhǎng)（p<0.05）。對(duì)于P.variotii，將溫度提高到30°C會(huì)導(dǎo)致PS更好的抑制，主要是在pH 5.0時(shí)，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)（6天；圖4C、D）沒(méi)有開(kāi)始生長(zhǎng)。
圖5、在(A)25°C和(B)在不同濃度的CP存在下，Penicillium roqueforti(PR06)的TTD-監(jiān)測(cè)時(shí)間）（OD=0.4 OD；6天）；對(duì)于PS在(C)25°C和(D)30°C。無(wú)論是否存在防腐劑，尤其是在檢查較高pH值時(shí)，P.roqueforti(PR06)菌株顯示了最長(zhǎng)TTD周期。
總結(jié)：面包的真菌腐敗是食品工業(yè)中一個(gè)持續(xù)存在的問(wèn)題，需要使用防腐劑來(lái)在環(huán)境儲(chǔ)存條件下為此類產(chǎn)品獲得必要的保質(zhì)期。本論文研究直接從生產(chǎn)設(shè)施中的變質(zhì)面包中分離出這些菌株，在分離的不同真菌物種中，普遍發(fā)現(xiàn)了H.burtonii，因?yàn)橐阎窃斐擅姘鞍l(fā)霉”缺陷的原因。P.variotii和P.roqueforti也經(jīng)常在衛(wèi)生條件差的面包店生產(chǎn)工廠中發(fā)現(xiàn)。這是第一次使用Bioscreen C快速生物測(cè)定系統(tǒng)詳細(xì)研究面包/烘焙產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中常用防腐劑的效果以及防腐劑對(duì)控制此類腐敗真菌的可能不同影響。本研究表明，使用該系統(tǒng)可以獲得一致且可重復(fù)的結(jié)果，以比較這兩種常用防腐劑在不同相互作用的非生物條件下模擬發(fā)酵面包產(chǎn)品中的條件/防腐劑對(duì)生長(zhǎng)的相對(duì)控制的功效。總的來(lái)說(shuō)，PS在控制H.burtonii和P.variotii的生長(zhǎng)方面比CP更有效，但對(duì)P.roqueforti尚不清楚.此外應(yīng)用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀這可能是一種有價(jià)值的快速替代工具，可用于挑戰(zhàn)測(cè)試以檢查使用不同防腐劑時(shí)新配方烘焙產(chǎn)品的保質(zhì)期。
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