溫帶的蠟樣芽孢桿菌噬菌體分離與鑒定
研究簡(jiǎn)介：芽孢桿菌屬可分為兩類:枯草芽孢桿菌屬和蠟樣芽孢桿菌屬。后者的成員包括炭疽桿菌、炭疽桿菌、蠟樣桿菌、威亨斯特法氏桿菌、圖林根氏桿菌、分枝桿菌和假菌類。蠟樣芽孢桿菌和威氏芽孢桿菌與食源性疾病和食物腐敗有關(guān)。它們的催冷特性使它們?cè)诘蜏刭A藏的食品中產(chǎn)生問題，特別是在乳制品中。蘇云金桿菌、分枝桿菌和擬桿菌也被發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致食物變質(zhì)。此外有證據(jù)表明它們可能導(dǎo)致食源性疾病。雖然迄今已分離出大量的芽孢桿菌噬菌體，但對(duì)蠟樣芽孢桿菌噬菌體進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定的研究較少。本論文的研究中，研究人員分離到一種溶性噬菌體vB_BceM_Bc431v3，該噬菌體具有很強(qiáng)的控制蠟樣芽胞桿菌的潛力。在將其應(yīng)用于食品保存之前，研究人員對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)鑒定并確認(rèn)其不會(huì)影響這種細(xì)菌的致病性。
本論文研究的目的是確定噬菌體Bc431v3的基因組序列，并結(jié)合科學(xué)文獻(xiàn)和GenBank中現(xiàn)有的噬菌體對(duì)其基因進(jìn)行注釋和結(jié)構(gòu)功能鑒定。Biosense生長曲線分析儀的高通量測(cè)試技術(shù)測(cè)定宿主特異性，研究過程中選定了芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用Biosense生長曲線分析儀，通過儀器的高通量測(cè)試技術(shù)測(cè)量在液體介質(zhì)的光密度(OD)來監(jiān)測(cè)細(xì)菌噬菌體的存在。
芬蘭Biosense全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
Biosense生長曲線分析儀的高通量測(cè)試技術(shù)可用于測(cè)定噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌的特異性。噬菌體的宿主細(xì)菌選定了芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用現(xiàn)場(chǎng)的測(cè)試技術(shù)，Biosense生長曲線分析儀的高通量測(cè)試技術(shù)測(cè)量在液體介質(zhì)的光密度(OD)來監(jiān)測(cè)細(xì)菌噬菌體的存在。該設(shè)備的使用設(shè)置如下:設(shè)定寬波段帶(wb)波長;25°C培養(yǎng)溫度;10分鐘預(yù)熱時(shí)間;動(dòng)態(tài)測(cè)量;測(cè)量時(shí)間24小時(shí)，間隔30分鐘，每次測(cè)量前后中等強(qiáng)度搖晃10秒。50毫升的噬菌體溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)消毒的消毒100孔Biosense蜂窩板中,然后每個(gè)孔接種125μl經(jīng)過一夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)液。利用Biosense生長曲線分析儀的數(shù)據(jù)處理軟件5.26版對(duì)吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定檢測(cè)時(shí)間(每口測(cè)試孔增加0.3 OD單位所需的時(shí)間)。將檢測(cè)時(shí)間(h:min)轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制值，取平均值，并從每個(gè)被測(cè)分離物的所有測(cè)試數(shù)據(jù)中減去平均控制檢測(cè)時(shí)間，并表示為檢測(cè)時(shí)間差。根據(jù)宿主特異性將噬菌體分為三組:(++)即噬菌體完全抑制宿主菌生長時(shí);(+)說明噬菌體延緩了宿主細(xì)菌的生長;（-）表明噬菌體對(duì)細(xì)菌的生長沒有影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Bc431v3顯示顯著的序列相似性,在蛋白質(zhì)水平到B仙人掌噬菌體BCP78、李斯特菌噬菌體A511、噬菌體?EF24C腸球菌和噬菌體感染相關(guān)的其他形態(tài)厚壁菌門如葡萄球菌噬菌體K和乳酸菌噬菌體LP65。基于這些數(shù)據(jù)將Bc431v3作為Spounavirinae的一員;然而由于所有不同的分類信息已被處理很難確定屬。Bc431v3噬菌體包含一些高度不尋常的基因，如gp143編碼假定的tRNAHis鳥苷轉(zhuǎn)移酶。此外它攜帶的一些基因似乎與宿主的孢子調(diào)節(jié)有關(guān)。這些是gp098，它編碼與FstK/SpoIIIE DNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的分離蛋白;gp105，一種推測(cè)的分離蛋白;gp108,RNA聚合酶sigma因子F/B;以及編碼RNA聚合酶西格瑪因子G的gp109。
圖1、已知有毒和無毒基因的混合物轉(zhuǎn)化效率的差異。柱狀圖顯示了兩個(gè)不同基因復(fù)制的樣品的CFU/ng值的平均值。
圖2、利用Biosense生長曲線分析儀測(cè)試分離的噬菌體宿主范圍。
圖3、使用全自動(dòng)生長曲線法確定噬菌體Bc431v3裂相對(duì)的裂解尺寸與時(shí)間的關(guān)系。
圖4、Biosense生長曲線分析儀應(yīng)用于測(cè)試不同菌株芽孢桿菌中添加噬菌體Bc431v3后的代表性微生物生長曲線圖，該噬菌體能夠完全抑制蠟樣芽孢桿菌LJH431的生長(完全裂解++）。而只延遲了B.cereus PAL 25的生長(部分裂解;+)。另一方面，c431v3既不能抑制也不能延遲枯草桿菌C1004的生長。蠟樣芽孢桿菌LJH431是指在沒有噬菌體Bc431v3的情況下，蠟樣芽孢桿菌LJH431的生長情況。
圖5、利用CGview制備噬菌體Bc431v3的遺傳和物理圖譜。Blast 1顯示了噬菌體Bc431v3蛋白與B.cereus噬菌體Bcp78蛋白的序列同源性。Blast 2顯示了噬菌體Bc341v3與李斯特菌噬菌體A511之間的序列同源性。裂解3顯示了序列之間的同源性噬菌體Bc431v3和噬菌體?EF24C腸球菌。在這些案例中，TBLASTX被用來在蛋白質(zhì)水平上搜索序列相似性。
總結(jié)：因?yàn)楹苌儆邢灅友挎邨U菌噬菌體被分離出來并被詳細(xì)描述。因此研究人員對(duì)一些溫帶的蠟樣芽孢桿菌噬菌體進(jìn)行了鑒定，并將其用于蠟樣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)分析。此外還有許多裂解性噬菌體已被分離出來，并用于流行病學(xué)研究的噬菌體分型方案。噬菌體分型被認(rèn)為是一種有效的方法，特別是因?yàn)橄灅友堪麠U菌、圖林根芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌之間有密切的親緣關(guān)系，為鑒定如此接近的物種提供了一種便宜、方便和相當(dāng)準(zhǔn)確的工具。研究人員提供了分離出一種大的、有毒的、廣泛的宿主范圍的蠟樣芽孢桿菌噬菌體vB_BceM_Bc431v3的數(shù)據(jù)(Bc431v3)。Bc431v3有一個(gè)158,618 bp的dsDNA基因組，包括239個(gè)假定的開放閱讀框(ORFs)和20個(gè)tRNA基因，它們編碼17種不同的氨基酸。研究人員為了確定噬菌體Bc431v3的基因組序列，并結(jié)合科學(xué)文獻(xiàn)和GenBank中現(xiàn)有的噬菌體對(duì)其基因進(jìn)行注釋和結(jié)構(gòu)功能鑒定。
采用了Biosense生長曲線分析儀的高通量測(cè)試技術(shù)測(cè)定宿主特異性，選定芽胞桿菌屬的菌株Bc431v3，利用Biosense生長曲線分析儀，通過儀器的高通量測(cè)試技術(shù)測(cè)量在液體介質(zhì)的光密度(OD)來監(jiān)測(cè)細(xì)菌噬菌體的存在。根據(jù)宿主特異性將噬菌體的生長曲線圖將所得的實(shí)驗(yàn)分為三組:(++)即噬菌體完全抑制宿主菌生長時(shí);(+)說明噬菌體延緩了宿主細(xì)菌的生長;（-）表明噬菌體對(duì)細(xì)菌的生長沒有影響。這也說明全自動(dòng)生長曲線分析儀在鑒定噬菌體的相關(guān)性能方面具有很好的應(yīng)用前景。
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