不同濃度的?全反式維甲酸對胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細胞生長影響
全反式維甲酸（All-trans-retinoic acid，ATRA）屬于類維甲酸家族成員，是維生素A的活性代謝產物，在細胞增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)育中具有重要作用。ATRA被認為是第一個腫瘤治療的靶向藥物，在臨床上主要用于治療急性早幼粒白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）。APL是急性髓系白血病的一種獨特亞型，表達早幼粒細胞白血病~維甲酸受體α（PML-RAR-α）癌蛋白，其特征在于纖溶酶產量增加導致嚴重出血。ATRA通過抑制纖溶酶的產生和降低膜聯(lián)蛋白A2和S100A100的表達在誘導白血病細胞分化、促進細胞凋亡以及改善出血癥狀等方面發(fā)揮了重要作用。ATRA的臨床應用將APL從一種高度致命的癌癥轉化為一種高度可治愈的疾病。
由于ATRA在APL中的臨床應用取得了巨大的成功，ATRA在治療多種人類惡性腫瘤方面得到了廣泛的研究。然而，APL的遺傳和生理病理簡單性在人類腫瘤中是相當罕見的，APL因此是目前發(fā)現(xiàn)的唯一對ATRA作出有效反應的惡性腫瘤。越來越多的研究表明，ATRA可以增強其它化療藥物的抗癌效應：在體外，ATRA與順鉑聯(lián)合應用可顯著抑制肝癌細胞的生長，促進其凋亡。ATRA與多西他奇（docetaxel）或泰索帝（taxotere）聯(lián)合應用可促進前列腺癌和乳腺癌細胞死亡的誘導。有機砷化三聚氰胺（Organic arsenical melarsoprol）與ATRA聯(lián)合使用可明顯抑制人乳腺癌和前列腺癌細胞的體外和體內生長。ATO（arsenic trioxide）還可與ATRA協(xié)同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌細胞的生長和凋亡。
受細胞系以及培養(yǎng)條件的影響，不同細胞對特定藥物的耐受性不同，在ATRA的使用中發(fā)現(xiàn)不同細胞的ATRA有效濃度不同：類維生素A 6-OH-11-O-羥基菲?。?-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF）是ATRA的合成衍生物。體外研究表明IIF可有效抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡。40μmol/L和80μmol/L的IIF處理24h可顯著誘導SaOS-2細胞凋亡，但對U2OS細胞沒有明顯效應。用5～50μmol/L的ATRA處理PANC-1細胞1-6 d，可呈劑量/時間依賴性抑制PANC-1細胞生長。1～10μmol/L維甲酸衍生物在多種腫瘤細胞中具有顯著的抗腫瘤作用，也有文獻報道10倍低濃度（100～500nm的）ATRA可以抑制人髓母細胞（Medulloblastoma，MB）的增殖。但是，一些研究發(fā)現(xiàn)吸煙者如果攝入維甲酸會導致肺癌發(fā)病率增高，暗示維甲酸可能具有促進腫瘤發(fā)生的作用。在五種鱗狀細胞癌（squamous cell carcinom，SCC）細胞中，20 nmol/L ATRA可導致細胞數(shù)增加30%，而40～100 nmol/L ATRA則可將細胞增殖減少20～30%[10].
硼替佐米（Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341）是用于治療多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）的臨床藥物。研究表明BTZ通過可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)，進而通過各種機制誘導細胞死亡，包括抑制核因子~Kβ的活性，激活p53，積累錯折疊蛋白等。
不同濃度的ATRA是否會對胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細胞產生不同的影響還未有研究，因此在本文中我們用濃度跨度較大的ATRA處理這兩種細胞。實驗結果表明，不同濃度的ATRA對PANC-1和U2OS細胞生長的影響不同，低濃度的ATRA促進PANC-1和U2OS細胞生長，高濃度則抑制其生長。我們還發(fā)現(xiàn)，BTZ可以通過凋亡途徑促進細胞死亡，ATRA的促生長或抑生長的作用都可被BTZ調控，同時低濃度ATRA與BTZ聯(lián)合應用會降低凋亡前蛋白Procaspase3的表達，表明聯(lián)合用藥可能影響細胞的凋亡途徑。
實驗結果
ATRA濃度不同對細胞生長的影響不同
實驗中用不同濃度的ATRA（5、10、20、40、80、100、150、200μmol/L）分別處理PANC-1和U2OS細胞24h，采用MTS法檢測ATRA對細胞活力的影響。結果顯示，ATRA對PANC-1細胞的生長依據(jù)濃度的不同而有不同的效果。在PANC-1細胞中，低濃度（20，40，80，100μmol/L）的ATRA表現(xiàn)出顯著的促進生長的趨勢（P<0.001）。相反的，高濃度（200μmol/L）ATRA可明顯抑制PANC-1細胞的生長。有趣的是，極低濃度的ATRA（5μmol/L）則表現(xiàn)出對PANC-1細胞生長的抑制作用（P<0.05），抑制率為89.50%±0.199（圖1A，表1）。在U2OS細胞中，我們也觀察到類似的現(xiàn)象。低濃度（10，20，40，80μmol/L）的ATRA可促進細胞的生長，特別是20，40μmol/L（P<0.01）。隨著濃度的升高，150，200μmol/L的ATRA表現(xiàn)出對U2OS細胞生長的顯著抑制作用（P<0.001）（圖1B，表1）。與PANC-1細胞不同的是，5μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS細胞的生長，這個獨特現(xiàn)象暗示PANC-1細胞中可能存在與U2OS細胞不同的ATRA應答方式。
高濃度ATRA抑制細胞生長的能力可被BTZ增強
為進一步檢測BTZ對ATRA作用的影響，我們繼續(xù)進行了高濃度ATRA聯(lián)合BTZ的用藥實驗。采用200μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ單獨或聯(lián)合處理PANC-1或U2OS細胞24 h，MTS實驗檢測細胞活力。結果顯示，高濃度的ATRA可以顯著抑制PANC-1和U2OS細胞的生長（P<0.001），聯(lián)合應用ATRA和BTZ可明顯抑制PANC-1和U2OS細胞的生長（P<0.001）（圖2，表2），與單獨應用ATRA相比，聯(lián)合用藥組都具有顯著差異（PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01）；與單獨應用BTZ相比，聯(lián)合用藥同樣具有顯著差異（P<0.01）（圖2）。
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