低溫對濕地填料內微生物生長分布及處理效能的影響研究
摘要：針對人工濕地低溫運行效率低、填料層內部結構對微生物生長分布影響不明確等問題，采用最大或然數(MPN)法對典型人工濕地正反級配試驗柱中氨化細菌、硝化細菌及反硝化細菌生長分布情況及對污染物去除效果進行檢測分析，研究環境溫度及濕地填料級配設置對微生物生長的影響。結果表明，低溫環境對濕地微生物生長均產生抑制，環境溫度為15℃的試驗柱各項污染物去除率均高于環境溫度為5℃的試驗柱，在相同環境溫度下，反級配試驗柱污染物去除效率優于正級配試驗柱。反級配試驗柱表層較大孔隙率使得氧氣更易進入填料層，因此上層填料中氨化細菌、硝化細菌數均高于同溫度下正級配試驗柱，而反硝化細菌數量則呈現相反的規律。污染物去除效率受環境溫度和反硝化底物濃度共同影響，本研究中環境溫度為15℃的反級配試驗柱對污染物的去除效率最優，其對COD、氨氮、TN污染物平均去除率可分別為46.18%、45.50%、45.28%。
人工濕地技術因工程建設費用低、處理效果好，被廣泛應用于污水處理廠尾水深度處理、河道凈化及生態恢復等領域[1-2]。但在實際應用過程中，人工濕地技術仍存在單位面積處理能力較低、冬季受低溫抑制影響較大等問題[3-4]。針對上述問題，新型濕地基質填料和低溫微生物菌劑的研發成為該領域的研究重點和難點[5-6]。王榮等[7]對正反級配填料垂直潛流濕地處理效能進行對比分析；王國強等[8]開發了以煤矸石、沸石為主材的人工濕地復合反級配填料方案；譚月臣等[9]采用保溫覆蓋、薄膜覆蓋、溫室大棚等方式提高低溫環境下人工濕地運行溫度；魏清娟[10]通過對填料層中耐低溫微生物的篩選、復配，開發新型耐低溫復合菌劑以提高低溫環境下人工濕地內微生物活性。然而由于人工濕地各處理單元內鋪設有大量硬質復合填料，對其進行監測和取樣相對困難，使得目前人工濕地技術的研究多以進出水水質優劣為唯一評價標準，對填料層內部微生物相分布及變化的研究相對較少。有研究表明，人工濕地反級配填料方案可在保證污染物去除效率的同時降低人工濕地填料堵塞速率，具有較好的應用前景。但反級配填料表層較大的孔隙率是否會在低溫環境下導致更多冷空氣進入填料層內部，進一步抑制填料層內微生物活性，此類研究鮮見報道。
本研究選取典型人工濕地正反級配方案，通過對常溫和低溫環境下微生物種類、分布及對各類污染物去除效果進行監測，從而研究低溫對人工濕地正反級配填料內微生物的影響，為人工濕地填料優化技術的研發提供基礎支持。
1材料與方法
1.1試驗裝置
試驗裝置為4根直徑250 mm，高100 cm的有機玻璃柱(見圖1)，沿有機玻璃柱體垂直方向表層、中層、底層3個位置設置內螺紋閥形取樣口，以便于在試驗過程中對不同填料層斷面微生物取樣分析。將2根有機玻璃柱采用傳統正級配填料方案進行填充，自柱底至上依次鋪設粒徑8～10 mm圓形卵石30 cm，粒徑5～8 mm礫石30 cm，粒徑3～5 mm細砂30 cm。另外兩個有機玻璃柱采用反級配填料方案進行填充，自柱底至上依次鋪設粒徑3～5 mm煤矸石30 cm，粒徑5～8 mm無煙煤30 cm，粒徑8～10 mm沸石30 cm。試驗于冬季進行，將1根正級配柱和1根反級配柱安裝于有供暖的實驗室內，控制試驗期間實驗室內環境溫度為(15±2)℃；將另1根正級配柱和1根反級配填料裝置安裝于可調節溫度的低溫實驗室內，控制試驗期間低溫實驗室內環境溫度為(5±2)℃。4根試驗柱的填料級配、試驗溫度設置見表1。
表1試驗設置
Table 1 Comparison of test device
1.2試驗水質
試驗進水為稀釋后的校園生活污水，進水水質如表2所示。
圖1試驗裝置
Fig.1 Flow chart of the device
表2進水水質
Table 2 Influent water quality
mg/L
1.3運行參數
試驗采用連續進水方式，水力負荷約為0.35 m3/(m2·d)，試驗時間為2016年12月至2017年1月。
1.4主要檢測指標及方法
試驗期間，分別檢測4根試驗柱出水COD、氨氮、TN指標及柱內表層、中層和底層填料內氨化細菌、硝化細菌和反硝化細菌數量。其中COD采用重鉻酸鉀法測定；氨氮采用鈉氏試劑分光光度法測定；TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定。柱內氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌數量采用最大或然數(MPN)法進行檢測，具體檢測方法如下[11]：分別從各試驗柱表層、中層和底層采集人工濕地填料樣本，將各填料樣本置于三角瓶內加蒸餾水浸泡，于搖床上振蕩30 min制成均勻懸濁液，采用10倍梯度稀釋法將懸濁液稀釋至不同梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)。每個稀釋度接種5管，另取一管接種1 mL無菌水作為對照，于25～30℃恒溫培養箱中培養。氨化細菌測定：取培養3、5 d的培養液觀察其渾濁度，取5滴培養7 d的培養液于比色板上，加納氏試劑溶液兩滴，產生棕褐色則表示產生氨，說明氨化細菌存在；硝化細菌測定：取培養14 d的培養液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯試劑Ⅰ和Ⅱ各兩滴，如不呈紅色表示亞硝酸已完全消失，此時，取培養液5滴于白瓷比色板上，加入二苯胺試劑2滴，如呈藍色則表示亞硝酸已經完全被氧化為硝酸，說明硝酸菌的存在，記錄每個稀釋度呈陽性培養管的數目；反硝化細菌測定：取培養14 d的培養液置于杜氏發酵管中檢查是否有氣泡出現，用納氏試劑檢查是否有氨氮產生，用二苯胺試劑檢查硝酸鹽，判斷反硝化作用進行的情況。
通過分別統計氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌相鄰3組稀釋度下陽性培養管數量，查詢MPN數值表確定上述菌群的統計數量。
2結果與討論
采用MPN法分別對1#、2#、3#、4#試驗柱內填料表層、中層和底層3處氨化細菌、硝化細菌和反硝化細菌數量及COD、氨氮、總氮等污染物去除效果進行檢測分析。研究低溫環境下上述各類微生物在濕地填料層間的分布及其對污染物去除效果的影響。
2.1氨化細菌分布情況
1#～4#試驗柱填料層不同位置處氨化細菌數量統計見表3。
表3試驗柱內各填料層氨化細菌數量統計
Table 3 Quantitative statistics of ammonification bacteria in each layer of column packing layer
由表3可見，各試驗柱內氨化細菌數均隨填料層深度增加而減少，環境溫度及填料級配均會對試驗柱氨化細菌數量產生影響。2#試驗柱各層氨化細菌數均為最高，其表層填料中氨化細菌數量達3.6×107個/g，是相同試驗溫度下1#試驗柱表層氨氮細菌數量(7.0×106個/g)的5.14倍，是低溫環境下3#、4#試驗柱表層氨化細菌數量的68、60倍。各試驗柱中層填料間氨化細菌數量明顯少于表層，2#試驗柱中層氨化細菌數量達7.0×104個/g，明顯高于其他3組試驗柱，1#、3#、4#試驗柱中層填料間氨化細菌數量差異較小；各試驗柱底層填料間氨化細菌數量差異較小。綜上可知，環境溫度為15℃時，由于反級配填料表層較高的孔隙率，大氣中氧氣易于進入填料層內部，使得試驗柱上層區域內氨化細菌數量顯著增加。但當環境溫度低至5℃時，正反級配試驗柱(3#、4#)內表層、中部和底層的氨化細菌數量差異較小，說明相較于濕地填料層間的溶解氧濃度影響，低溫對氨化細菌增長有著更明顯的抑制作用。
對4組試驗柱的COD去除效果進行對比分析，結果見圖2。由圖2可見，各試驗柱對COD的去除效率由高至低排序為2#>1#>4#>3#，其COD平均去除率分別為46.18%、44.58%、40.91%、40.13%。環境溫度為15℃時，2#試驗柱對COD去除效率高于1#試驗柱，在環境溫度為5℃時，4#試驗柱對COD的去除效率略優于3#試驗柱，但差異較小，COD去除效果與試驗柱內氨化細菌數量監測結果總體一致。
圖2各試驗柱對COD的去除效果
Fig.2 The COD removal efficiency of different columns
2.2硝化細菌分布情況
1#～4#試驗柱填料層不同位置處硝化細菌數量統計見表4。
表4試驗柱內各填料層硝化細菌數量統計
Table 4 Quantitative statistics of nitrifying bacteria in each layer of column packing layer
由表4可見，4組試驗柱內硝化細菌數自表層至底層呈現逐步遞減的趨勢，其中表層硝化細菌量由多至少排序依次均為4#>2#>1#>3#，中層硝化細菌量由多至少排序依次均為4#>3#>2#>1#，其中4#試驗柱表層硝化細菌數量最多，為7.0×105個/g，是同樣溫度下3#試驗柱表層硝化細菌數量的30.4倍，是1#、2#試驗柱表層硝化細菌數量的2.0、1.4倍。3#、4#試驗柱中層填料中硝化細菌數量高于1#、2#試驗柱，可能是在5℃下低溫導致濕地填料表層和中層氨化細菌等好氧菌生長受抑制，使其對填料層間氧氣的消耗量降低，進而為同樣消耗填料層間氧氣并與其生長呈競爭關系的硝化細菌增長提供了空間和便利條件。而4組試驗柱底層填料硝化細菌數量基本相同且數量較少，說明此區域多處于缺氧環境，硝化細菌生長困難。由于反級配試驗柱填料表層有更高的孔隙率，空氣更易于進入濕地填料層內部，為硝化細菌生產和硝化反應提供有利條件，故在相同溫度下反級配試驗柱硝化細菌數均高于同條件下的正級配試驗柱。
對各試驗柱氨氮去除效率進行分析，結果見圖3。由圖3可見，4組試驗柱對氨氮去除效率由高至低依次為2#>1#>4#>3#，其氨氮平均去除率分別為45.50%、43.16%、40.98%、39.60%，環境溫度為15℃的1#、2#試驗柱對氨氮去除效果高于環境溫度為5℃的3#、4#試驗柱。在相同環境溫度下，反級配試驗柱對氨氮去除效率高于正級配試驗柱。結合表4可知，雖然3#、4#試驗柱的硝化細菌數量均多于1#、2#試驗柱，但低溫環境抑制了硝化細菌的活性，影響其硝化效率，同時低溫條件下氨化細菌數量減少使得進水中有機氮氨化效率降低，減少了硝化反應所需氨氮底物濃度，亦是造成3#、4#試驗柱硝化細菌數量高而硝化效果卻低于1#、2#試驗柱的原因之一。
圖3各試驗柱對氨氮的去除效果
Fig.3 The ammonia removal efficiency of different columns
2.3反硝化細菌分布情況
1#～4#試驗柱填料層不同位置處反硝化細菌數量統計見表5。
表5試驗柱內各填料層反硝化細菌數量統計
Table 5 Quantitative statistics of denitrifying bacteria in each layer of column packing layer
由表5可見，受溶解氧和溫度影響，各試驗柱中反硝化細菌數量沿表層至底層均呈現逐步增加的趨勢。1#試驗柱表層反硝化細菌數量為1.1×103個/g，其余3組試驗柱表層反硝化細菌數量均大幅減少；4組試驗柱的中層反硝化細菌數量由高至低分別為1#>3#>4#>2#，底層反硝化細菌數由高至低依次為1#>2#>3#>4#。1#試驗柱各層反硝化細菌數量均明顯高于其他3組試驗柱，這是因為較高環境溫度下，表層異養菌和硝化菌對填料層間氧氣的消耗、正級配填料自身相對較低的大氣復氧傳導能力等，使適宜缺氧環境的反硝化細菌在1#試驗柱內大量生長。由于空氣易于通過反級配填料表層和中層區域，使反級配填料上中層溶解氧濃度較高，故本試驗期間2#、4#反級配試驗柱內反硝化細菌數量均少于正級配試驗柱。2#、4#試驗柱中各層反硝化細菌數基本相同，2#試驗柱底層反硝化細菌數略高于4#試驗柱，說明環境溫度的變化對反級配填料中反硝化細菌的生長影響較小。與1#試驗柱相比，3#試驗柱各層填料間反硝化細菌數量下降明顯，且反硝化細菌隨填料深度增加而增長的遞增趨勢消失，中層、底層反硝化細菌數量基本相同，說明低溫對正級配填料中反硝化細菌生長產生明顯的抑制作用。綜上可知，正級配填料方案可為反硝化細菌的生長提供更好的生存環境，反級配填料表層較大的孔隙率不僅使填料層間形成好氧區影響反硝化細菌的生長，而且使得低溫空氣進入填料層內部，強化了填料層內部熱量的流失，進一步降低了填料層內部區域溫度，抑制反硝化細菌生長。
對試驗期間各試驗柱TN去除效果進行檢測，結果見圖4。1#～4#試驗柱對TN的平均去除率分別為44.58%、45.28%、38.06%、39.63%，環境溫度為15℃的1#、2#試驗柱脫氮效率高于5℃下的3#、4#試驗柱，說明環境溫度是制約人工濕地脫氮效率的首要因素。其次，由于相同條件下反級配試驗柱硝化效率更好，對氨氮的去除效果更高，為后續反硝化提供了更多的硝態氮底物，故雖然試驗過程中正級配試驗柱的反硝化細菌數量高于反級配試驗柱，但相同反應溫度下反級配試驗柱對總氮的去除率更高，可見供給反硝化脫氮的底物濃度亦是制約脫氮效率的重要因素。由于潛流濕地設計水力停留時間普遍在24 h以上，在較長的反硝化時間下，相對較少的反硝化細菌數量亦可完成對硝態氮的反硝化反應，故相較于濕地填料層中反硝化細菌數量，填料層中供給反硝化脫氮的硝態氮底物濃度是影響濕地脫氮效果更重要的制約條件。
圖4各試驗柱對TN去除效果
Fig.4 The TN removal efficiency of different columns
3結論
(1)低溫對正反級配人工濕地的污染物處理效率均產生明顯抑制作用，環境溫度為15℃的1#、2#試驗柱對污染物去除效率優于環境溫度為5℃的3#、4#試驗柱。
(2)在相同環境溫度下，反級配試驗柱對于污染物去除效率優于正級配試驗柱，其中2#試驗柱對COD、氨氮和TN污染物的去除效率最優，其COD、氨氮和TN污染物平均去除率可分別為46.18%、45.50%、45.28%。
(3)由于反級配試驗柱表層較大孔隙率使得氧氣更易進入填料層，因此反級配試驗柱上層氨化細菌數量、硝化細菌數量均高于同環境溫度下正級配試驗柱，溫度越高，細菌數量差異約明顯。本研究中，環境溫度為15℃的反級配試驗柱(2#試驗柱)中氨化細菌、硝化細菌數最高。
(4)受環境溫度和反硝化底物濃度影響，反硝化細菌較少的反級配填料反硝化效果較好，對TN去除效率由高至低排序為2#>1#>4#>3#。
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