探究P2Y2受體在人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）增殖過程中的作用
隨著人們生活節(jié)奏加快，子宮頸癌（cervical cancer）在中國女性群體中的發(fā)病率逐漸上升，已成為常見的婦科疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已占世界的三分之一左右［1］。研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌與HPV感染、p53和Rb失活、端粒酶激活、抑癌基因表達(dá)失常、癌基因激活和炎性細(xì)胞因子等密切相關(guān)，是多基因改變，多步驟發(fā)生的一類全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［2-4］。P2Y2受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族的典型代表，廣泛分布于正常組織中且具有組織特異性［5］。研究證明，P2Y2受體在多種癌癥患者組織及細(xì)胞中均有表達(dá)，其中Kyse-140食管癌細(xì)胞系、T47-D乳腺癌細(xì)胞系及Hela子宮頸癌細(xì)胞系等均可特異性表達(dá)P2Y2受體［6-7］，結(jié)合P2Y2受體其在介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖，分化和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用，提示P2Y2受體可能參與子宮頸癌病理生理過程。2-硫代-UTP是P2Y2受體的特異性激動劑，其可通過活化P2Y2受體激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，P2Y2受體活化后也可與其他受體相互作用，從而影響其自身與G蛋白發(fā)生偶聯(lián)的能力［8-9］。P2Y2受體拮抗劑蘇拉明可有效阻斷P2Y2受體功能及其下游活動，進(jìn)而抑制P2Y2受體介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)［10］。本研究通過特異性拮抗劑和激動劑處理Hela細(xì)胞，在細(xì)胞水平上探究P2Y2受體在Hela細(xì)胞增殖過程中的作用，在研究子宮頸癌新型治療靶點和手段等方面具有重要意義。
實驗材料
人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞，KCB 86019YJ）由中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫提供。DMEM培養(yǎng)基由HyClone公司提供，小牛血清由四季青生物工程材料有限公司提供，2-硫代-UTP和蘇拉明由索萊寶生物科技有限公司提供，TNF-α和IL-6檢測試劑盒由博士德生物工程有限公司提供，CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒由天根生化科技有限公司提供，山羊抗兔P2Y2多克隆抗體由Abcam公司提供，GAPDH單克隆抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，qPCR試劑盒由TakaRa公司提供，總RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。
實驗分組
細(xì)胞所用培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基（含10%小牛血清和1%青鏈霉素混合液），實驗分為3組，即：正常對照組、2-硫代-UTP處理組（50μmol／L）和蘇拉明（100μmol／L）處理組，所用藥物均用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，所用細(xì)胞均控制在30代以內(nèi)。
CCK-8法檢測細(xì)胞活性
按照實驗所設(shè)分組，用96孔板接種細(xì)胞，密度約為1×104／mL，每孔100μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔，共接種3塊孔板。細(xì)胞貼壁后行藥物干擾，每間隔6h進(jìn)行一次細(xì)胞活性檢測，檢測8次，共48h。CCK-8儲存液按1：10的比例DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞處理后更換CCK-8稀釋液，每孔100μL，于37℃培養(yǎng)箱（5%CO2）孵育2h，450nm檢測每孔的吸光度，以吸光度大小表示各組細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞生長曲線。
細(xì)胞活性檢測結(jié)果與生長曲線
各處理組細(xì)胞8個時間點的活性檢測結(jié)果如表1所示，根據(jù)表1繪制細(xì)胞生長曲線（見圖1）。結(jié)果顯示，2-硫代-UTP處理組細(xì)胞較對照組生長速率明顯加快，以第24h時間點生長速率出現(xiàn)最大值，且達(dá)到平臺期所用時間也有所縮短。蘇拉明處理組細(xì)胞生長速率均顯著低于對照組和2-硫代-UTP處理組，且未出現(xiàn)細(xì)胞接觸抑制現(xiàn)象。
表1各時間點細(xì)胞活性檢測結(jié)果（±s）
討論
子宮頸癌是女性群體高發(fā)腫瘤疾病之一，僅次于乳腺癌，位列女性惡性腫瘤的第二位。中國是子宮頸癌高危大國，近年來其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］。目前，子宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，探索新型有效的治療靶點對防治子宮頸癌等疾病具有重要意義。P2Y受體家族是一類具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，目前已從哺乳動物細(xì)胞中成功克隆出8種功能性P2Y受體亞型，I類受體包括P2Y1、P2Y2、P2Y、P2Y、P2Y，II類受體包括P2Y～P2Y［11-12］。
46111214近年來研究發(fā)現(xiàn)，P2Y受體家族尤其是P2Y2受體，在多種癌癥組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，并在癌細(xì)胞的增殖，分化和轉(zhuǎn)移等活動中扮演重要角色［13-14］。根據(jù)不同時間點的細(xì)胞活性檢測結(jié)果繪制各處理組細(xì)胞生長曲線，從中可以看出，正常生長的Hela細(xì)胞生長曲線呈典型的“S”狀，而2-硫代-UTP處理組細(xì)胞指數(shù)生長期的斜率大于對照組，且其到達(dá)平臺期所用的時間明顯比對照組縮短，即2-硫代-UTP可通過激活P2Y2受體功能促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。與之相反，經(jīng)蘇拉明處理后的細(xì)胞生長速率明顯減慢，且細(xì)胞未達(dá)到接觸抑制時即出現(xiàn)平臺期，表明蘇拉明通過阻斷P2Y2受體功能可抑制了Hela細(xì)胞活性。
研究發(fā)現(xiàn)，P2Y受體激活后可進(jìn)一步活化不同的G蛋白，進(jìn)而引發(fā)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［15］。P2Y2受體可通過激活Gq／11或Gi／o等類型的G蛋白，激活PLC途徑，介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2＋和炎性介質(zhì)釋放，進(jìn)而激活下游NF-κB轉(zhuǎn)錄因子及CaMKII，最終產(chǎn)生促增殖效應(yīng)或介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。也有研究認(rèn)為，2-硫代-UTP可通過P2Y2受體引起APE1／Ref-1活化，或?qū)е率荏w本身過表達(dá)［17］。從細(xì)胞生長曲線可看出，各處理組細(xì)胞均在第24h時間點生長速率達(dá)到最大值，因此我們選擇檢測第24h時間點各組細(xì)胞P2Y2受體表達(dá)情況。我們通過qPCR和Western blot實驗確定了在Hela細(xì)胞中可表達(dá)P2Y2受體，且經(jīng)2-硫代-UTP處理后的細(xì)胞中P2Y2受體mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，表明2-硫代-UTP在激活P2Y2受體功能的同時也可上調(diào)其受體本身的表達(dá)，而蘇拉明處理組中以上指標(biāo)均無顯著變化。
ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)2-硫代-UTP處理后的細(xì)胞IL-6水平明顯升高，蘇拉明處理組細(xì)胞也觀察到了TNF-α釋放量的增加。結(jié)合IL-6與細(xì)胞活化和增殖相關(guān)，尤其是其可作為生長因子刺激腫瘤細(xì)胞，特別是骨髓瘤細(xì)胞的增殖和遷移以及TNF-α能顯著殺傷腫瘤細(xì)胞活性［18-19］等研究背景，推斷P2Y2受體對Hela細(xì)胞活性的影響可能與其介導(dǎo)IL-6或TNF-α等炎性介質(zhì)相關(guān)。
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P2Y2受體功能激活能促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖，阻斷其受體功能可顯著抑制Hela細(xì)胞活性。這將為研究新型有效的抑癌靶點及探索子宮頸癌潛在的治療手段等方面提供科學(xué)依據(jù)。
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