菌株雙控制生長開關及其應用的遺傳穩(wěn)定性（一）
代謝工程和合成生物學為將細菌轉化為生物工廠，從廉價的底物中生產(chǎn)有價值的化合物提供了廣泛的可能性。用于生物生產(chǎn)的微生物工程相當于代謝通量從生長到產(chǎn)品合成的重新定位。這種細胞資源的重新分配面臨著產(chǎn)量和生產(chǎn)力之間的基本權衡。產(chǎn)量的增加，即底物轉化為產(chǎn)物的比例，會增加代謝負荷，從而降低生長速率。較低的生長速率導致較慢的生物量積累，并因此降低生產(chǎn)率，即降低感興趣的化合物的總生產(chǎn)率。
處理這種權衡的一種廣泛使用的方法是交替生長和生產(chǎn)階段。沿著這些思路，研究人員在大腸桿菌中開發(fā)了一種合成生長開關，其中表達RNA聚合酶兩個主要亞單位β和β′的操縱子受到異丙基-b-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導型啟動子的嚴格調控。研究發(fā)現(xiàn)，通過調節(jié)誘導劑的外部濃度，可以開啟或關閉生長。此外，在生長停滯后，細菌能夠從葡萄糖中產(chǎn)生甘油，產(chǎn)量接近理論最大值。
從進化的角度來看，許多合成回路都是脆弱的，因為攜帶該回路的宿主菌株被其必須運行的環(huán)境反向選擇。這也適用于生長開關，即解除RNA聚合酶ββ’亞基編碼基因抑制的自發(fā)突變會導致生長中的突變細菌迅速超過生長停滯的細菌群。生長開關的設計包括防止突變發(fā)生的保護措施，特別是編碼阻遏物LacI的基因的冗余。然而，當在大規(guī)模生物反應器中進行高密度培養(yǎng)的長時間發(fā)酵過程時，有害的突變體發(fā)生的概率更高，并且這些保護措施可能是不夠的。在大腸桿菌中，突變率約為每代每核苷酸2×10-10，這意味著在高細胞密度下，平均幾次細胞分裂就足以使任何核苷酸突變。
通過建立進一步的冗余，可以控制RNA聚合酶表達的合成回路的遺傳穩(wěn)定性的進一步增加。在這里，研究人員開發(fā)了一種菌株，其中RNA聚合酶的另一個亞單位α被置于用于控制ββ’亞單位表達的同一lac系統(tǒng)的控制之下。因此，只有編碼α(rpoA)和ββ′(rpoBC)的基因上游的兩個啟動子區(qū)域同時突變，才能使RNA聚合酶的表達控制失效，從而使生長控制失效。這顯著增加了生長開關及其應用的遺傳穩(wěn)定性。
研究內容：
1.RNA聚合酶表達雙調控大腸桿菌菌株的構建
圖1生長開關的交替設計：單控制（SC）和雙控制（DC）
研究人員首先將編碼β和β‘亞基的rpoBC基因置于一個可誘導啟動子的控制下，來控制RNA聚合酶的表達。利用同源重組將天然啟動子替換為T5啟動子、兩個lac操作子和大觀霉素抗性。轉錄調控因子LacI與lac操縱序列結合，從而阻止RNA聚合酶轉錄rpoBC基因。當IPTG結合時，LacI與操縱符序列分離，從而緩解了基因的抑制。rpoBC基因也與核糖體基因rplKAJL一起被組織成一個操縱子。為了避免控制rplKAJL表達的啟動子的通讀轉錄，因此在大觀霉素抗性基因的上游添加了一個強終止子（圖1a）。
使用上述系統(tǒng)，可以通過IPTG外部控制RNA聚合酶的表達。當在培養(yǎng)基中添加IPTG時，會產(chǎn)生ββ‘-亞基，細菌正常生長。然而，在沒有IPTG的情況下，rpoBC基因不被轉錄，也沒有形成新的RNA聚合酶全酶。因此，細胞產(chǎn)生生物合成功能所需的RNA和蛋白質的能力下降，并最終停止生長。然而，這些細菌仍然具有代謝活性，可以利用它來引導營養(yǎng)物質從生長到產(chǎn)生一種感興趣的化合物。
這種方法的一個缺點是，LacI基因的突變會阻止抑制因子與T5啟動子區(qū)域結合，在生長停滯的條件下是非常有益的，因為有豐富的營養(yǎng)物質，但沒有IPTG供應。攜帶這些突變的細菌能夠在這些條件下生長，并將很快超過培養(yǎng)物。為了使生長開關對突變更穩(wěn)定，因此在染色體上的不同位點上克隆了另外兩個lacI拷貝（圖1b）。這種冗余降低了由于lacI突變而失去生長控制的風險。這種策略導致了一個至少能穩(wěn)定24小時的系統(tǒng)。
為了滿足這一要求，研究人員進一步推進了冗余策略，將α-亞基基因置于第二個相同的T5啟動子的控制下。α-亞基由rpoA基因編碼，rpoA基因包含在核糖體基因rpsMKD和rplQ的操縱子中。與rpoBC基因相反，rpoA沒有一個單獨的啟動子，并與核糖體基因共轉錄。為了避免核糖體基因的表達受到干擾，研究人員將rpoA克隆到sokA-insKJ-hokA序列中，用氯霉素抗性取代了rpoA的自然拷貝（圖1c，d）。
2.RNA聚合酶表達的雙重控制導致了一個功能性的生長開關
SC菌株表現(xiàn)出一種開關樣的誘導模式:對于低濃度的IPTG，菌株不生長，而高于閾值濃度，菌株的生長速度與WT菌株大致相同。為驗證在DC菌株中實現(xiàn)的ββ'‐和α‐亞基誘導控制的改進設計是否保留了這種開關表型。研究人員將SC和DC菌株在M9最小培養(yǎng)基中預培養(yǎng)，添加0.2%葡萄糖和250μM IPTG，以保證RNA聚合酶的表達和生長。將預培養(yǎng)物洗滌并重新稀釋到相同的培養(yǎng)基中，但添加了不同濃度IPTG，范圍為0至500μM。
在SC應變的曲線中，0-20μM的IPTG中，由于預培養(yǎng)中RNA聚合酶的積累，有一些殘留的生長，當RNA聚合酶被稀釋后停止。然而，吸光度仍然可以忽略不計。相反，當濃度為40μM或更高時，rpoBC的誘導足以使菌株生長，其速度與WT菌株相似。為了量化這一觀察結果，研究人員確定了生長培養(yǎng)物在指數(shù)中期的生長速率，并將生長受阻的菌株的生長速率設置為0（圖2c）。該圖清楚地顯示出了SC應變在IPTG閾值濃度附近的開關行為。
DC菌株也表現(xiàn)出一個開關表型，具有近似相同的開關閾值，盡管在40μM時，尚未達到最大的生長速率（圖2b）。此外，其最大生長速率低于WT菌株。DC的生長產(chǎn)量，即限制碳源（0.2%葡萄糖）產(chǎn)生的最大生物量，也低于WT菌株，這與SC菌株的觀察結果相反（圖2a，b）
圖2單調控（SC）和雙調控（DC）菌株的生長開關行為
這兩種菌株的不同設計可以解釋SC菌株和DC菌株轉換表型的差異。對于高IPTG水平，SC中β‘-亞基的濃度高于WT菌株。因為rpoB和rpoC以大約相同的速率共轉錄和翻譯，這可能也適用于β-亞基。因此，在SC菌株中，功能核心RNA聚合酶的濃度將受到高IPTG水平下（自然表達的）α-亞基的濃度的限制。然而，在DC菌株中，rpoA也是從T5啟動子轉錄出來的（并且與rpoB具有相同的核糖體結合位點）。考慮到ω-亞基是非必需的，因此，對于高水平的IPTG，DC中功能核心RNA聚合酶的濃度高于SC中。這可能導致不必要的更高的轉錄活性，導致適應度成本，從而導致生長缺陷。
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