順-6-十八碳烯酸在制備抗真菌藥物之真菌生長曲線的測定
近年來，隨著癌癥患者、器官移植接受者、老年患者等免疫功能低下人群的不斷增加，侵襲性真菌感染(Invasive Fungal Infections，IFIs)的發病率和死亡率日漸攀升。侵襲性念珠菌感染(Invasive Candidiasis，IC)在IFIs中占主要地位，其死亡率粗略估計已高于40％，這其中又以白念珠菌(Candida albicans)為主要感染菌株。白念珠菌除了能以酵母態和菌絲態引起人體淺部和深部真菌感染以外，還能通過形成結構致密的生物被膜附著在內臟表面或生物材料的表面，難以清除，造成反復感染。目前臨床上常用的抗真菌藥物包括唑類、多烯類、棘白菌素類、丙烯胺類等，隨著傳統藥物的經年使用，臨床上真菌耐藥的現象日益增多，這也成為真菌感染治療失敗的主要原因之一。除此之外，傳統抗真菌藥物或多或少存在著毒性大、有效率低、價格昂貴等問題，難以滿足人類健康的需求，亟需開發高效、低毒的新型抗真菌藥物。
順-6-十八碳烯酸(Petroselinic Acid，下文中全部使用PeAc代表順-6-十八碳烯酸)是存在于芫荽、胡蘿卜等植物中的不飽和脂肪酸。
已有研究顯示：PeAc能調節腸道細菌菌群(Genes.2022；13(11):1967.)。PeAc是牙齦卟啉單胞菌的殺菌劑，是植物提取物防治牙周疾病的主要有效成分(Microbiol.2022；13:816047.)。PeAc能抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的生物被膜)，PeAc還能抑制金黃色葡萄球菌毒力因子的產生(Microbiologyspectrum.2022；10(3):e0133022.)。PeAc能減輕腸缺血/再灌注損傷小鼠的腸道損傷并減少細胞凋亡(British journal of anaesthesia.2022；128(3):501-12.)。真菌界(eumycetes)是生物的一界，是一大類高等真核生物，與細菌完全不同，以上報道多為PeAc抗病原細菌的研究報道，而本發明中涉及的PeAc抗病原真菌的研究，目前國內外尚未見有關報道。
單倍體不足效應分析(haploinsufficiency profiling，HIP)是行之有效的發現抗真菌藥物靶標的方法之一。文獻報道二倍體的真菌在缺失了一個編碼藥靶的等位基因后基因劑量(gene dose)減半，該藥靶基因缺失菌對藥物的敏感性大幅度上升，這種現象被稱為單倍體不足效應。研究人員可以通過構建基因敲除菌庫，利用單倍體不足效應篩選對藥物敏感的基因敲除菌，從而鑒定出藥靶。2014年Science曾報道利用釀酒酵母基因敲除菌庫鑒定出了氟康唑的藥靶Erg11p和他莫西芬的藥靶Neo1p(Science.2014；344(6180):208-11)。科學家還利用單倍體不足效應明確了Turbinmicin抗真菌的藥靶是Sec14p(Science.2020；370(6519):974-8)，F901318抗真菌的藥靶是二氫乳酸脫氫酶(DHODH)(Proc Natl Acad Sci U S A.2016；113(45):12809-14)，化合物G884、G365抗真菌的藥靶是Gwt1p(ACS Infect Dis.2015；1(1):59-72)等。
真菌生長曲線的測定
白念珠菌接種于YPD液體培養基中30℃培養16h。吸取活化好的菌液至1.5ml離心管中，于3000g離心1min，吸棄培養基后用PBS洗一次，離心棄上清，用1ml PBS重懸，稀釋后取10μl至血細胞計數板計數。在開始培養前，取未經稀釋的原菌液于96孔板第一列A1-C1孔中(三復孔)，200μl/孔，第2-10列各孔分別加入100μl RPMI 1640液體培養基，從第一列開始倍比稀釋至第10列，測量各孔OD630，并根據各孔不同的OD630
值(x)及其相對應的菌濃度(y)作圖得到標準曲線。隨后用RPMI 1640液體培養基稀釋并調整菌液濃度至1×106cells/ml。將菌液分成數份，轉移至50ml離心管，每管10ml。每管菌液中分別加入不同濃度(2、4、8μg/ml)的待測藥物PeAc，隨后在加入2μg/ml PeAc的幾個管中又分別加入不同濃度(4、16、64μg/ml)的FLC，4、8μg/ml PeAc的幾個管中進行同樣的操作。最后剩余3管，一管只加8μg/mlPeAc，一管只加64μg/ml FLC，一管不加藥。所有含菌液的離心管于30℃恒溫震蕩培養箱中，以200rpm振蕩培養，分別于0、2、4、8和12h時在各組菌液中吸取100μl于96孔板中(取之前渦旋混勻各管菌液)測各孔的OD630，利用標準曲線擬合的方程計算各組不同培養時間節點的菌濃度，并以log10 CFU/ml對時間作曲線。實驗結果見下圖，PeAc與氟康唑聯用抗耐藥真菌的量效關系的測定結果示意圖。
結果顯示，單用氟康唑(64μg/ml)或者單用PeAc(8μg/ml)8h后有顯示出一定的抑制白念珠菌生長的作用，12h后抑制作用則迅速減弱，白念珠菌生長情況與對照組接近。當固定PeAc濃度為2μg/ml時，與4、16、64μg/ml氟康唑合用，發現隨氟康唑濃度的升高，兩藥協同對耐藥菌的抑制作用也增加，但組內的抑制效果差異并不明顯。而隨著PeAc濃度的增加，兩藥合用的抑制耐藥菌生長的能力也逐漸加強，尤其是當PeAc濃度達到8μg/ml時，與4、16、64μg/ml氟康唑合用，發現兩藥合用抑制耐藥菌生長效果顯著，組內的抑制效果差異明顯，尤其是“PeAc 8μg/ml+FLC 64μg/ml”的組合使耐藥菌的生長抑制在較低水平。因此，兩藥合用協同抗真菌的作用與PeAc的量效關系更明顯。