忍冬提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線、細(xì)胞形態(tài)和生物膜形成能力的影響（四）
2.3忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC和MBC
金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris均有較強(qiáng)的抑制作用，但抑制效果隨濃度的降低而減弱（表2）。當(dāng)提取液濃度為3.91 mg/mL時，仍表現(xiàn)出抑制作用，培養(yǎng)液仍澄清透明。因此，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MIC均為3.91 mg/mL。在MIC值的基礎(chǔ)上，測定了金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MBC值。結(jié)果表明，金銀花與忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的殺菌效果相同，當(dāng)提取液濃度為31.25 mg/mL時，仍無活菌存在，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MBC值均為31.25 mg/mL。
表2忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的MIC和MBC
2.4忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線的影響
微生物生長過程中，菌液濃度往往與OD600 nm下的吸光度呈正相關(guān)，因此可通過測定A.acidoterrestris相應(yīng)培養(yǎng)時間與A.acidoterrestris菌液吸光度之間的變化來判定A.acidoterrestris的生長狀況。測定不同濃度的金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris生長曲線的影響以進(jìn)一步探究其抑菌作用（圖2）。對照組的A.acidoterrestris正常生長，遲緩期為2 h，隨后進(jìn)入對數(shù)期，在12 h時A.acidoterrestris菌液密度最高，其吸光度達(dá)到（1.301±0.032），隨后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。當(dāng)花和葉抑菌濃度為1 MIC時，菌體生長被抑制，直至24 h時，菌體開始生長，吸光度分別為0.159±0.032和0.144±0.021，兩者抑菌效果無顯著性差異（P>0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到2 MIC時，A.acidoterrestris的生長明顯被抑制，24 h內(nèi)菌液的吸光度均無明顯變化。隨著提取液濃度繼續(xù)增大到MBC時，A.acidoterrestris無生長跡象。結(jié)果表明，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的抑菌效果相同，并隨著濃度的增大，抑菌效果更明顯。
圖2忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線的影響
2.5忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響
對照組A.acidoterrestris呈現(xiàn)桿狀，菌體形態(tài)完好，表面光滑，未觀察到細(xì)胞破損或內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象（圖3）。隨著金銀花和忍冬葉提取液濃度的增大，A.acidoterrestris的菌體形態(tài)發(fā)生不同程度的變化。當(dāng)濃度為1 MIC時，A.acidoterrestris的菌體表面變得粗糙，出現(xiàn)褶皺和凹陷現(xiàn)象。濃度為2 MIC時，A.acidoterrestris的菌體損傷更明顯，呈凹凸不平的無規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞界限變得模糊，表面出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞基質(zhì)出現(xiàn)外泄現(xiàn)象。在4 MIC濃度下，A.acidoterrestris的菌體被嚴(yán)重破壞，內(nèi)容物溶出，細(xì)胞膜幾乎完全破裂，難以維持正常形態(tài)。Cai等使用綠原酸和肉桂酸處理A.acidoterrestris，研究發(fā)現(xiàn)綠原酸和肉桂酸對A.acidoterrestris的抑菌作用機(jī)制歸因于對菌體細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生破裂，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸的泄漏。Li等研究發(fā)現(xiàn)，對香豆酸對A.acidoterrestris的作用機(jī)制是由于對香豆酸的作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP減少，對香豆酸可以與DNA相互作用，干擾正常的細(xì)胞功能，A.acidoterrestris細(xì)胞膜完整性受損，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)畸變。綜上所述，忍冬提取液對A.acidoterrestris的抑制作用可能是忍冬中豐富的綠原酸、多酚和黃酮等活性成分嚴(yán)重破壞了A.acidoterrestris的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使菌體形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞基質(zhì)外泄，難以正常生長。
圖3忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響
注：（a）：不同濃度金銀花提取液對脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響；（b）：不同濃度忍冬葉提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響；A：Control，B：1 MIC，C：2 MIC，D：4 MIC。
2.6忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
如圖4（a）所示，經(jīng)忍冬不同部位提取液處理后，A.acidoterrestris的生物膜量顯著低于對照組（P<0.05），且隨著金銀花和忍冬葉提取液濃度的增大，染色液OD590 nm值整體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，與之對應(yīng)的96孔板顏色逐漸變淺（圖4（b））。當(dāng)提取液濃度為4 MIC時，OD590 nm值最小，其對應(yīng)培養(yǎng)孔的顏色與AAM培養(yǎng)基顏色相近。金銀花提取液對A.acidoterrestris的生物膜的形成有較大的影響，低濃度條件下可有效減少生物膜生成量，高濃度時可完全抑制生物膜的生成，且忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的生物膜形成能力的影響與金銀花提取液無顯著性差異（P>0.05），這與其對A.acidoterrestris生長曲線的影響結(jié)果是相同的（圖2）。細(xì)菌的生物膜形成能力代表著細(xì)菌處于適宜條件下通過分泌胞外多糖從而達(dá)到形成細(xì)菌菌落的能力，而生物膜形成能力越強(qiáng)的菌體表面越渾濁，吸光度越大，細(xì)胞膜形成能力明顯降低，表明金銀花和忍冬葉提取液能抑制生物膜的形成，對生物被膜具有清除作用。菌體生物被膜主要包括胞外多糖和蛋白質(zhì)，忍冬提取液對A.acidoterrestris生物膜的抑制作用，可能是提取液中的綠原酸等生物活性成分影響了A.acidoterrestris分泌胞外多糖，菌體內(nèi)蛋白質(zhì)組分出現(xiàn)損失，從而使得OD值降低。
圖4忍冬不同部位提取液對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
注：（a）：金銀花和忍冬葉提取液處理后酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)液染色后的吸光度；（b）：金銀花和忍冬葉提取液處理后酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)液染色后的圖片。不同大寫字母表示同一部位不同濃度間差異顯著（P<0.05），不同小寫字母表示不同部位同一濃度間差異顯著（P<0.05）。
3.結(jié)論
忍冬葉和金銀花中的總酚、總黃酮和綠原酸含量均顯著高于忍冬藤（P<0.05）。三個部位提取液對A.acidoterrestris、S.agalactiae、L.monocytogenes、S.aureus、B.subtilis、E.coli和Salmonella均具有一定的抑制效果，且忍冬葉和金銀花提取液的抑菌效果優(yōu)于忍冬藤。此外，忍冬葉和金銀花提取液對A.acidoterrestris的抑菌效果最明顯，MIC值均為3.91 mg/mL，MBC值均為31.25 mg/mL，且抑制效果隨提取液濃度的增加而增強(qiáng)。忍冬葉和金銀花提取液能有效抑制A.acidoterrestris菌體生物膜的形成。掃描電鏡結(jié)果顯示，忍冬葉和金銀花提取液處理后的A.acidoterrestris菌體形態(tài)發(fā)生畸變，胞內(nèi)基質(zhì)發(fā)生泄露。本研究為闡明忍冬抑制A.acidoterrestris的機(jī)制奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)，忍冬有望成為果汁生產(chǎn)中抑制A.acidoterrestris污染的新型高效抑菌劑。但細(xì)菌的生物被膜形成能力與營養(yǎng)條件、環(huán)境等多種因素有關(guān)，因此忍冬對A.acidoterrestris生物膜形成的影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
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