撒壩豬耳緣組織成纖維細胞系生長曲線、生物污染檢測結(jié)果——材料與方法
摘要：實驗采用撒壩豬耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對撒壩豬成纖維細胞進行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了撒壩豬耳緣成纖維細胞系；并對其細胞形態(tài)、細胞活率、細胞核型等生物學特性進行分析；還利用透射電鏡觀察了耳緣組織細胞。結(jié)果表明：細胞倍增時間為48 h，生長曲線為“S”型；染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為92.56%；細菌、真菌、病毒和支原體等微生物污染檢測均顯示為陰性。透射電鏡觀察顯示，成纖維細胞呈長梭型。
隨著全球生物多樣性及其遺傳資源喪失程度的加劇，使得各國紛紛投入大量人力和財力，并以多種方式收集、保存和整理大自然賦予人類的寶貴財富，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture，ECACC)都相繼保存了大量生物資源的培養(yǎng)物。
云南地方物種豐富，撒壩豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，耐粗飼、抗病力強、肉質(zhì)好(味好鮮嫩)，為農(nóng)民增收做出了極大的貢獻，是較好的地方品種。作為我省的特色品種，為了更好地保護和利用撒壩豬遺傳資源，非常有必要開展撒壩豬種質(zhì)資源保存研究。與傳統(tǒng)的活體保存相比，體細胞保存具有占用場地小、投資少、不受群體和個體生理利用年限制約、可以長期保存種質(zhì)資源等優(yōu)勢。為加強撒壩豬這一獨特地方品種保護，本試驗以撒壩豬耳緣組織為材料，體外培養(yǎng)和建立了成纖維細胞系，并對其生物學特性進行了研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實驗材料：撒壩豬來源于楚雄州種豬場，試驗用組織塊來源于2月齡撒壩豬耳緣組織。
1.1.2主要試劑、儀器：胎牛血清(FBS)、高糖DMEM由Gibco公司生產(chǎn)。胰蛋白酶和青鏈霉素溶液購自Bioind公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。
主要儀器設備：CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、倒置相差顯微鏡(Olympus，Nikon)、透射電鏡(JEM-1011)、實體顯微(Olympus)、微生物立體計數(shù)儀等。
1.2方法
1.2.1耳緣組織成纖維細胞的分離培養(yǎng)
撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。取耳緣組織樣本0.6 cm×0.6 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液洗3次，放入高糖DMEM+1%青鏈霉素中，放入4℃泡沫箱，確保24 h內(nèi)帶回實驗室進行培養(yǎng)。超凈臺上剪刀刮去皮膚表面污物。PBS清洗4次后，用手術(shù)剪和鑷子剪成碎塊，放入直徑為50 mm培養(yǎng)皿中，每皿8塊左右進行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，飽和濕度)中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察、照相，記錄細胞遷移和增殖情況。
1.2.2成纖維細胞傳代培養(yǎng)
當細胞長至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80%左右時，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)37℃消化5 min后，倒置相差顯微鏡下觀察。當細胞開始變圓時，加細胞培養(yǎng)液終止消化，吹打細胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3的比例進行傳代。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。
1.2.3成纖維細胞冷凍與復蘇
胰酶消化收集細胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用凍存液調(diào)整細胞濃度為1～3×107/mL左右，充分混勻，分裝于凍存管中。標明細胞名稱、凍存管編號、性別和凍存日期。-80℃冰箱過夜，次日投人液氮罐中長期保存。細胞凍存液為高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亞砜(DMSO)。
細胞復蘇時將凍存管從液氮中取出，迅速投人42℃水浴鍋中1 min，不停搖動使其受熱均勻。轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞。移至培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察復蘇細胞生長狀況，并拍照。
1.2.4耳緣組織透射電鏡觀察
撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。用消毒好的耳號鉗取材后，用鋒利的手術(shù)剪立即剪小并放入裝有3.5%戊二醛的離心管中固定，放入4℃泡沫箱，送昆明醫(yī)學院電鏡中心進行透射電鏡分析。
1.2.5成纖維細胞生長曲線測定
取傳至第2代的撒壩豬成纖維細胞，胰酶消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105個/孔，接種于24孔培養(yǎng)板。從第2天開始到細胞長滿，每天隨機取3孔，連續(xù)7 d記數(shù)。用血球計數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，取其平均值，以時間(d)為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標繪制細胞生長曲線。
1.2.6撒壩豬成纖維細胞的核型檢測
取培養(yǎng)至匯合度為85%左右，并處于對數(shù)生長期的細胞為試驗材料，參照Sun Y L方法進行染色體制備。
1.2.7細胞活率測定及微生物檢測
對凍存前后的第2、4、6代細胞進行PI染色，統(tǒng)計計算細胞存活率。微生物檢測參見Doyle，Hay RI和Guan等。
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