產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（五）
2.8鹽度對LD-1302產(chǎn)酶的優(yōu)化
由圖8可知：以橄欖油為有機碳源、接種量為3.75×105CFU/mL、pH 8、37℃時，菌株LD-1302在鹽度32時有最大脂肪酶活，為（34.97±1.45）U/mL。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)可知：鹽度、時間的P=0.00<0.01，表明鹽度、時間均對酶活影響極顯著；由鹽度-酶活的同類子集結果可知：鹽度36時酶活均值為22.88 U/mL；鹽度28、30、34時酶活均值分別為25.71U/mL、28.60U/mL、27.29U/mL，在同一子集中，表明三者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果略優(yōu)于前者；鹽度32時酶活均值為30.59 U/mL，且與前四者分屬不同子集，表明鹽度32時，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由時間-酶活的同類子集結果可知：24 h、48 h、72 h時酶活均值分別為27.72U/mL、30.65U/mL、22.68U/mL，分屬不同子集，表明三者對酶活的影響有明顯差異，且培養(yǎng)時間為48 h時，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。隨著鹽度的增加或減少，菌株LD-1302的產(chǎn)脂肪酶活性都有一定程度的降低，尤其是隨鹽度的增加，脂肪酶活下降較為顯著。
圖8鹽度對LD-1302利用橄欖油產(chǎn)脂肪酶的影響
3討論
本研究采用高溫水浴法從海南熱帶海水中篩選得到產(chǎn)脂肪酶活性較高的地衣芽孢桿菌LD-1302。當前，已報道的產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、芽孢桿菌B5-12、芽孢桿菌WF63、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等（胡德朋等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強等，2010；Akanbi et al.2010），其脂肪酶活依次為2.8 U/mL、24.8U/mL、6.33U/mL、2.51 U/mL，均低于菌株LD-1302的酶活。菌株LD-1302最適應用于鹽度32、pH 8、溫度37℃的海水環(huán)境，在鹽度28～36、pH 5～9、27℃～47℃的海水條件下也存在較穩(wěn)定產(chǎn)脂肪酶活性，并可在蔗糖等速效碳源及橄欖油、椰子油和葵花籽油等有機碳源的誘導下產(chǎn)較高脂肪酶活，這與本研究基于海水環(huán)境下篩選產(chǎn)脂肪酶活性菌株并在該環(huán)境條件下闡述影響其產(chǎn)酶活性的主要環(huán)境因素直接相關。
有關學者篩選的產(chǎn)脂肪酶活性的菌株均是在淡水或者添加NaCl不超過10‰的環(huán)境下篩選的（李鑫玲等，2011；胡德朋等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強等，2010；Akanbi et al，2010；魏濤等，2011；陳林林等，2010；劉秀花等，2006；Eltayib et al，2010），盡管這些菌株也存在一定的產(chǎn)脂肪酶活性，但其對海水環(huán)境的適應性尚未見報道。海水中含有Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Sr2+、Ba2+等多種離子，存在較高滲透壓，對芽孢桿菌等細菌產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性存在抑制作用（曹煜成等，2005；朱彥博等，2013），導致眾多在鹽度很低及不含上述離子條件下存在產(chǎn)脂肪酶活較高的菌株的產(chǎn)酶活性大大降低甚至消失。從菌株LD-1302的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹可知，雖然菌株LD-1302與Genbank中其他菌株的同源性均為99.9%，卻沒有明顯地高度聚為一支，由此我們推斷菌株LD-1302很可能為海南熱帶海洋環(huán)境中的地衣芽孢桿菌菌株，比目前常用的芽孢桿菌對熱帶海水環(huán)境具有更強的適應能力。這可能是在長期的歷史進化過程中，海南獨特的熱帶沿海地理環(huán)境形成了獨特的微生物細菌地理種群。
橄欖油的主要成分為棕櫚酸C16H32O2、亞油酸C18H32O2、油酸C18H34O2、硬脂酸C18H36O2等的甘油三酯（湯富彬等，2013），菌株LD-1302產(chǎn)生的脂肪酶可將這些甘油三酯分解為C16-C18的游離高級脂肪酸，這些游離高級脂肪酸不溶于水浮于水的表面形成絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)，這是菌株LD-1302發(fā)酵24 h后在三角瓶中產(chǎn)生的浮于培養(yǎng)基表面的絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)的原因，隨著發(fā)酵時間的延長，這些絮凝狀乳白色蠟樣高級脂肪酸的混合物逐漸消失，推測菌株LD-1302除了產(chǎn)脂肪酶外，還可能產(chǎn)生烴類水解酶等其它酶類，將絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)分解為水溶性物質(zhì)或小分子氣體。石油是一類以C6-C20的烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴類為主的油質(zhì)，近年來，我國海面溢油與深海溢油事件時有發(fā)生，這嚴重破壞了海洋生態(tài)環(huán)境，一定程度上制約了海洋經(jīng)濟的可持續(xù)健康發(fā)展（馬麗等，2013；廖國祥等，2011；楊建強等，2011），而微生物修復技術因高效安全、環(huán)境友好、無二次污染等優(yōu)勢，被逐漸應用于修復溢油、深海水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成的海洋環(huán)境污染（王麗娜等，2013；鄭天凌等，2001），所以菌株LD-1302很可能對被石油污染的熱帶海洋環(huán)境存在較好的修復作用，當然，這還有待進一步的深入研究。
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