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產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（二）

來源：海洋通報發布時間:2024-12-30 16:05:15 瀏覽：276 次

1.3產脂肪酶菌株的篩選

吸取10mL水樣至100mL滅菌海水中，180r/min、30℃振蕩10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、靜置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液體培養基中，在180 r/min、30℃下培養。2 d后，吸取5 mL富集培養菌液至100 mL新鮮的富集液體培養基中，進行二次富集，如此連續富集培養3次。吸取1 mL第3次富集培養菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-4；吸取100μL稀釋度為10-4的菌液在羅丹明B顯色初篩培養基上涂布，挑選在羅丹明B顯色初篩培養基上水解圈較大且在350 nm紫外燈下橙黃色熒光亮斑較大的菌落為篩選分離菌株。挑取菌落繼續于羅丹明B顯色初篩培養基上重復3次劃線分離培養，直到菌落形態一致。挑取羅丹明B顯色初篩培養基上的單菌落至復篩固體培養基上重復劃線培養，直至單菌落不再染上羅丹明B顯色劑。挑選在復篩固體培養基上的單菌落至改良產酶發酵培養基中，于200 r/min、30℃下振蕩培養48 h，測定篩選得到菌株的產脂肪酶活性，以最優產脂肪酶活性的菌株為目的菌株。

1.4菌株鑒定

1.4.1菌落形態及鏡檢

挑取純化單菌落于計數固體培養基上劃線，參照沈萍等的方法進行革蘭氏染色、芽孢染色（沈萍等，2005）。

1.4.216S rDNA序列測定和分析

單菌落振蕩培養18 h后，按照北京艾德萊生物科技有限公司的細菌基因組DNA快速提取試劑盒的說明提取目的菌株DNA，對菌株進行16S rDNA序列的PCR擴增與測序（徐先棟等，2012）。

1.4.3生理生化鑒定

挑取純化單菌落，參照東秀珠的方法進行VP測定、丙酸鹽、淀粉水解、明膠水解、V-P培養物終pH>7、檸檬酸鹽、55℃、pH 5.7、pH 6.8、NaCl 5%、NaCl 7%等理化指標試驗（東秀珠等，2001）。

1.5活菌總數計數

吸取6 mL目的菌株過夜培養液（于生長培養基中培養10-12 h）轉入盛有60 mL生長培養基的三角瓶中，混勻后分別吸取5 mL混合液至標記0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20的12支無菌大試管中。于30℃、250 r/min條件下培養，并于相應時間點將標有對應時間的大試管取出，分別吸取1 mL各個時間點的生長培養菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-5。吸取100μL稀釋度為10-5的菌液于計數固體培養基上涂布、計數。

1.6脂肪酶活力的測定

在40℃、pH 7.5條件下，以1 min催化水解反應底物（橄欖油）釋放1μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶活力單位（U）（施巧琴，1998）。搖瓶發酵48 h后，吸取發酵上清液于8 000 r/min、4℃下離心5 min，吸取上清酶液備用，參照李建武等的方法測定所篩菌株的產脂肪酶活（李建武等，1994）

1.7產酶條件的優化

改良產酶發酵培養基瓶裝量為50 mL/250 mL時，根據接種量、碳源、pH、溫度、鹽度等影響產脂肪酶的因素，依次進行LD-1302產脂肪酶活條件的優化。

1.7.1接種量對產酶的影響

研究菌起始濃度為5×105CFU/mL的LD-1302的接種量分別為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%時，對LD-1302產脂肪酶的影響，每隔24 h測定酶活一次，連續測定3次，篩選最適溫度接種量。

1.7.2碳源對產酶的影響

研究以1%的橄欖油、椰子油、葵花籽油為碳源時，對LD-1302產脂肪酶活性的影響，每隔24 h測定酶活一次，連續測定3次，篩選最適碳源。

1.7.3pH對產酶的影響

研究改良產酶發酵培養基起始pH分別為5、6、7、8、9時，對LD-1302產脂肪酶的影響，每隔24 h測定酶活一次，連續測定3次，篩選最適pH。

1.7.4溫度對產酶的影響

研究改良產酶發酵培養基搖瓶發酵溫度分別為27℃、37℃、47℃時，對LD-1302產脂肪酶的影響，每隔24 h測定酶活一次，連續測定3次，篩選最適溫度。

1.7.5鹽度對產酶的影響

研究海水鹽度分別為28、30、32、34、36時，對LD-1302產脂肪酶的影響，每隔24 h測定酶活一次，連續測定3次，篩選最適鹽度。