丙酸銨&中鏈脂肪酸可抑制飼料腐敗真菌謝瓦列曲霉生長(zhǎng)
研究背景：在飼料中添加防腐劑丙酸銨和中鏈脂肪酸（MCFA）對(duì)耐干燥真菌謝瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的協(xié)同抗真菌效果。謝瓦列曲霉是一種常見的飼料腐敗真菌，能在低水分活性條件下生長(zhǎng)，導(dǎo)致飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，并可能產(chǎn)生有害的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如霉菌毒素，影響動(dòng)物健康和產(chǎn)品安全。丙酸作為一種廣泛使用的有機(jī)酸防腐劑，在低水分環(huán)境中能有效抑制多種腐敗細(xì)菌、酵母和絲狀真菌的生長(zhǎng)，包括產(chǎn)毒的曲霉菌。然而工業(yè)應(yīng)用中為了安全和便利，常將丙酸與氨水合用形成丙酸銨，這一過程雖然減輕了丙酸的刺激性，但也降低了其抗真菌效力。為彌補(bǔ)這一不足，研究者探索了添加MCFA以增強(qiáng)丙酸銨的抗真菌效果。MCFA是一系列飽和的脂肪酸，包括辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）和月桂酸（C12:0），它們因其親脂性質(zhì)而具有抗菌性，可能通過影響細(xì)胞膜或干擾能量產(chǎn)生過程中的膜定位過程來發(fā)揮作用。本研究中，通過實(shí)驗(yàn)方法研究者評(píng)估了丙酸銨和MCFA單獨(dú)以及組合使用對(duì)謝瓦列曲霉休眠和發(fā)芽分生孢子、芽管和菌絲的影響。研究發(fā)現(xiàn)丙酸銨和MCFA的組合處理對(duì)謝瓦列曲霉的休眠分生孢子具有顯著的協(xié)同抗真菌效果，幾乎完全抑制了菌落的形成。此外該組合處理還顯著降低了發(fā)芽率，并在對(duì)菌絲的短暫處理中增加了細(xì)胞死亡。顯微鏡觀察顯示，組合處理導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)扭曲和損傷，包括線粒體形態(tài)的異常變化，表明可能發(fā)生了自噬。本研究的發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高飼料和食品儲(chǔ)存的安全性和穩(wěn)定性具有重要意義，為開發(fā)新的或改進(jìn)現(xiàn)有的抗真菌劑提供了科學(xué)依據(jù)。通過使用丙酸銨和MCFA的組合，可能更有效地控制飼料中的真菌生長(zhǎng)，減少經(jīng)濟(jì)損失，并提高動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)被用來監(jiān)測(cè)和量化謝瓦列曲霉分生孢子的腫脹和隨后的發(fā)芽過程。同時(shí)也可實(shí)時(shí)捕捉到分生孢子在不同處理?xiàng)l件下的變化，包括細(xì)胞的膨脹和發(fā)芽管的形成。該設(shè)備能獲取96孔平底微量滴定板中沉降細(xì)胞的，使研究人員能夠在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)多種處理對(duì)分生孢子腫脹和芽管形成的影響。將分生孢子以105個(gè)分生孢子/ml的密度懸浮在麥芽提取物培養(yǎng)基中，并且對(duì)所有處理進(jìn)行六倍測(cè)試。對(duì)于每次測(cè)量，每孔使用100μl的104個(gè)分生孢子，并且作為對(duì)照，監(jiān)測(cè)對(duì)照麥芽提取物培養(yǎng)基中的分生孢子。用于采集圖像、對(duì)象跟蹤（包括分割）、對(duì)象計(jì)數(shù)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析。對(duì)于采集，選擇24次重復(fù)，每孔2小時(shí)時(shí)間間隔，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)孔的中心拍攝10個(gè)圖像。對(duì)于分割使用fungHmin算法（對(duì)比度=0.40，閾值=25.00），對(duì)于生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析，使用SESAfungiNormalized算法，用于計(jì)算增長(zhǎng)率（特定增長(zhǎng)率）的最大斜率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
研究發(fā)現(xiàn)丙酸銨和中鏈脂肪酸（MCFA）的組合對(duì)謝瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的休眠分生孢子、發(fā)芽分生孢子、芽管和菌絲具有顯著的協(xié)同抗真菌效果。這種協(xié)同作用在低濃度下就能顯著提高抗真菌活性。通過透射電子顯微鏡觀察，丙酸銨和MCFA的組合處理導(dǎo)致真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)扭曲和損傷，包括線粒體形態(tài)的異常變化，這表明可能發(fā)生了細(xì)胞自噬。使用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)獲得的生長(zhǎng)曲線顯示，丙酸銨和MCFA的組合處理延遲了真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，并降低了其最大特定生長(zhǎng)率。丙酸銨和MCFA的組合處理顯著降低了真菌細(xì)胞的活性，增加了細(xì)胞損傷和死亡率。丙酸銨和MCFA的組合可能在飼料和食品儲(chǔ)存領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力，有助于減少真菌污染和延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。
圖1、不同處理方法對(duì)雪蓮分生孢子的影響。分生孢子大小約為5μm。
圖2、發(fā)芽的雪蓮分生孢子的。在經(jīng)過或未經(jīng)處理的麥芽提取物培養(yǎng)基中孵育21小時(shí)后。a.)在對(duì)照培養(yǎng)基中可以看到許多芽管的發(fā)育。b.)PA1處理后可見一些芽管和腫脹的分生孢子。c.)經(jīng)過M1處理的胚管d.)PAM1中的一些腫脹孢子。
圖3、使用oCelloScope與各種成分一起孵育的單個(gè)分生孢子的延時(shí)。之間的時(shí)間間隔為2小時(shí)。
圖4、與各種成分一起孵育的細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。使用ocelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的SESA NORMALIZED算法根據(jù)細(xì)胞邊界內(nèi)占據(jù)的總面積的增加并在6個(gè)孔中獲得的生長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算。
圖5、萌發(fā)分生孢子的比生長(zhǎng)率。根據(jù)oCellscope軟件的歸一化SESA算法獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算得出的。R腳本使用各個(gè)孔中顯示的生長(zhǎng)曲線的4個(gè)連續(xù)點(diǎn)（log(1+x)值）。最大斜率被解釋為特定增長(zhǎng)率的指示。通過方差分析對(duì)這些值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)試，然后進(jìn)行事后Tukey檢驗(yàn)。
總結(jié)
本研究旨在探究中鏈脂肪酸（MCFA）對(duì)丙酸銨配方的增強(qiáng)效果，評(píng)估其對(duì)飼料腐敗真菌謝瓦列曲霉的休眠和發(fā)芽分生孢子、芽管和菌絲的抗真菌作用。通過實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，使用不同濃度的丙酸銨和MCFA單獨(dú)或組合處理，對(duì)謝瓦列曲霉的不同發(fā)育階段進(jìn)行了抗真菌效果評(píng)估。實(shí)驗(yàn)包括了對(duì)休眠分生孢子、發(fā)芽分生孢子、芽管和菌絲的觀察和分析。研究發(fā)現(xiàn)丙酸銨和MCFA組合處理對(duì)休眠分生孢子具有顯著的抗真菌效果，幾乎完全抑制了菌落的形成。發(fā)芽率在16 mM丙酸銨和0.26 mM MCFA存在時(shí)顯著降低，而單獨(dú)使用MCFA時(shí)對(duì)發(fā)芽影響不顯著。對(duì)菌絲的短暫處理顯示，組合處理相比單獨(dú)成分顯著增加了細(xì)胞死亡。顯微鏡觀察揭示了丙酸銨和MCFA組合處理導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)扭曲，包括線粒體形態(tài)異常，暗示了細(xì)胞自噬的發(fā)生。丙酸銨和MCFA的組合對(duì)謝瓦列曲霉的真菌生存結(jié)構(gòu)在發(fā)芽和生長(zhǎng)細(xì)胞的短暫處理期間具有協(xié)同抗真菌效果。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于飼料和食品儲(chǔ)存領(lǐng)域具有潛在的重要性，有助于提高產(chǎn)品的安全性和延長(zhǎng)保質(zhì)期。oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的使用為本研究提供了一種高效、精確的方法來評(píng)估不同抗真菌劑對(duì)真菌生長(zhǎng)和發(fā)育的影響，這對(duì)于開發(fā)新的食品和飼料保存策略具有重要意義。
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