拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（一）
由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的煙草赤星病主要危害成熟期的烤煙上部葉，發(fā)病嚴(yán)重地塊幾乎絕收，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量。目前化學(xué)防治依然是防治煙草赤星病的主要措施，然而長期使用化學(xué)藥劑易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和危害人畜健康等問題，且近年來有研究報(bào)道鏈格孢菌對96%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）苯醚甲環(huán)唑和97%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氟環(huán)唑及93%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）菌核凈等藥劑已產(chǎn)生抗藥性。而生物防治具有無毒、無殘留和對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，成為植物病害防治研究的熱點(diǎn)之一。
目前，植物病害生物防治中應(yīng)用最廣泛的為芽胞桿菌屬細(xì)菌，因其有抗菌譜廣、耐鹽性強(qiáng)、能產(chǎn)生多種拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性強(qiáng)和生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，具有較高應(yīng)用價(jià)值。宋莉莎等從貴州省甕安縣煙區(qū)土壤中篩選具有拮抗作用的細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）對鏈格孢菌有較強(qiáng)的抑制作用，其無菌發(fā)酵液對該病菌抑菌帶可達(dá)23.5 mm。從福建、山東和云南等地?zé)煵萑~片中分離得到187株菌株，發(fā)現(xiàn)萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽類物質(zhì)對鏈格孢菌菌絲生長也有明顯抑制作用，抑制率分別為56.9%和65.0%。
前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙區(qū)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重，部分地塊發(fā)病率高達(dá)100%，幾乎絕收，給當(dāng)?shù)責(zé)熮r(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為篩選對該地區(qū)煙草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5點(diǎn)取樣法，從貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重地塊采集健康煙株根際土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行芽胞桿菌分離純化，使用平板對峙法篩選對病原真菌具有較好拮抗作用的菌株，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其進(jìn)行鑒定，并通過盆栽試驗(yàn)測定該拮抗菌L249對煙草赤星病防治效果，旨在為煙草赤星病的生物防治提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
供試土樣采集于貴州省清鎮(zhèn)市衛(wèi)城鎮(zhèn)煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重地塊健康烤煙根際，采用5點(diǎn)取樣法取樣后用無菌自封袋封存并編號(hào)。供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）、高粱葉點(diǎn)霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、煙草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），均由貴州大學(xué)煙草學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。供試烤煙品種為K326，選用長53 mm、寬35 mm、高58 mm規(guī)格的育苗盆育苗，每盆1株，待烤煙幼苗生長至5片真葉時(shí)，移栽至底徑為140 mm、口徑180 mm、高160 mm花盆中繼續(xù)生長至8~10片葉備用。
供試藥劑為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（WDG）（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），供試試劑有1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）草酸銨結(jié)晶紫、明膠及9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl溶液等。
1.2方法
1.2.1土壤拮抗菌分離
采用稀釋涂布平板法，稱取10 g土樣放入含90 mL無菌水的錐形瓶中，置于37℃、200 r/min恒溫?fù)u床振蕩20 min。85℃水浴處理10 min后梯度稀釋得到濃度為10-2、10-3、10-4和10-5的土壤懸浮液。取100μL稀釋液均勻涂布于LB平板，各濃度3個(gè)重復(fù)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待平板長出單菌落后，挑取形態(tài)不同的單菌落純化后編號(hào)，置于LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，與30%（體積分?jǐn)?shù)）甘油等比例混合后置于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.2拮抗菌抑菌譜測定
將5種植物病原真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，分別取直徑為6 mm的菌餅接種到PDA平板中央（培養(yǎng)皿直徑為85 mm），距中央2.5 cm處再接種5μL拮抗菌菌液，以只接種病原菌的PDA平板為對照，每種病原菌接種4個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次（下同）。待對照長滿培養(yǎng)皿后，測量抑菌帶寬度并挑取鏈格孢菌邊緣菌絲，置于Axio Imager M2蔡司金相顯微鏡（德國Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）下觀察菌絲形態(tài)。采用十字交叉法測量菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長抑制率。
生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）*100%
1.2.3拮抗菌生長曲線測定
將保存的拮抗菌活化后挑取單菌落接種到裝有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，置于37℃、200 r/min條件下的搖床中培養(yǎng)12 h后，獲得種子液。使用移液槍吸取1 mL種子液接種于100 mL的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，采用比濁法，每隔30 min用分光光度計(jì)在600 nm波長處測定菌液的吸光度值（OD），直至OD值緩慢下降時(shí)停止測量。
1.2.4生物膜測定
將活化的芽胞桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.0時(shí)，4℃離心收集菌體，用無菌水洗滌后重懸于等體積的MSgg培養(yǎng)基中。取5 mL MSgg培養(yǎng)基加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分別滴加10μL菌懸液，于37℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察成膜情況。
1.2.5拮抗菌生防相關(guān)酶類測定
將篩選出具有良好拮抗作用的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、200 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)后，滴加5μL菌液至蛋白酶檢測培養(yǎng)基和纖維素酶檢測培養(yǎng)基中央，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生消解圈。
1.2.6拮抗菌鑒定
結(jié)合形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對篩選的拮抗菌進(jìn)行鑒定。
（1）菌落形態(tài)觀察：將活化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取5μL菌液接種于LB平板中央并置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)特征。
（2）生理生化指標(biāo)：參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，對拮抗細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色、酶的水解、明膠的液化、檸檬酸鈉鹽的利用、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)及耐鹽試驗(yàn)等多項(xiàng)生理生化特征分析。
（3）16S rDNA、gyrA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析：使用BioTeke細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用細(xì)菌通用引物16S rDNA及gyrA對提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（北京）股份有限公司測序。測序結(jié)果修正后經(jīng)NCBI進(jìn)行BLAST初步比對，根據(jù)比對結(jié)果下載親緣關(guān)系較近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0軟件上對各菌株的序列進(jìn)行修正后，以黃熱厭氧芽胞桿菌（Anoxybacillus flavithermus）為外群，使用MEGA 5.0軟件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。
表1用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株號(hào)及GenBank登錄號(hào)①
1.2.7拮抗菌防治煙草赤星病盆栽試驗(yàn)
待烤煙生長至8~10片葉時(shí)進(jìn)行處理，采用噴霧法將濃度為1×108 cfu/mL的拮抗菌發(fā)酵液均勻噴施在煙草葉片正面，以液滴不滴落為標(biāo)準(zhǔn)，晾干后在葉片上接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d、直徑為6 mm的鏈格孢菌菌餅，每片煙葉接種4個(gè)菌餅。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：以噴施無菌水的煙株為CK1；噴施無菌水晾干后接種病原菌的煙株為CK2；噴施發(fā)酵液晾干后接種病原菌的煙株為處理3；噴施2 000倍液10%苯醚甲環(huán)唑WDG晾干后接種病原菌的煙株為處理4。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株煙苗。置于光照和黑暗各12 h、溫度為28℃、相對濕度為90%以上的溫室中培養(yǎng)，直至CK2出現(xiàn)明顯病斑時(shí)，根據(jù)赤星病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害調(diào)查（以葉片為單位），并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效。
計(jì)算公式：
1.3數(shù)據(jù)分析
使用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，運(yùn)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan’s新復(fù)極差法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。
拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（一）
拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內(nèi)防治效果（二）
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