產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（一）
從海南熱帶海水中分離篩選得到10株產(chǎn)脂肪酶菌，其中菌株LD-1302產(chǎn)脂肪酶活性最高。根據(jù)16S rDNA序列分析和生理生化試驗結(jié)果，鑒定該菌為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。對該菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，在pH 8、溫度37℃、鹽度32的條件下，經(jīng)橄欖油誘導(dǎo)，起始濃度為3.75×105CFU/mL的LD-1302搖瓶發(fā)酵48 h時產(chǎn)脂肪酶活最高，脂肪酶活可達（34.97±1.45）U/mL。
海南管轄海洋面積200多萬km2，海洋資源豐富；不過，當前海水養(yǎng)殖產(chǎn)生的含大量殘餌、動物殘體的養(yǎng)殖廢水及其它來源油脂性污水的任意排放，造成了該海區(qū)海洋環(huán)境的存在脂肪污染，嚴重影響當?shù)睾Ｑ笊鷳B(tài)環(huán)境的健康（周永燦等，2013；Nejidat，2005）。因此，安全有效清除海南熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖和海洋環(huán)境中的脂肪是熱帶海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)和可持續(xù)利用的重要前提。脂肪酶是催化長鏈脂肪酸甘油酯水解和合成的羧酸酯酶，廣泛存在于動植物和微生物，其中以微生物脂肪酶資源最為豐富；因其廣泛的底物特異性、在有機溶劑中穩(wěn)定性好、易于大規(guī)模生產(chǎn)及純化等優(yōu)點而成為當代酶工業(yè)最受矚目的酶種之一（李鑫玲等，2011；彭立鳳等，2006；閆云君等，2006），也是環(huán)境中脂肪降解的主要原動力。
海南為我國唯一的熱帶沿海地區(qū)，在長期自然進化過程中，海南地區(qū)形成了獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)，存在豐富的產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌資源，為安全解決海南熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖和海洋環(huán)境中脂肪污染問題奠定了重要基礎(chǔ)（朱彥博，2013；吳海武，2014）。不過，有關(guān)產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的海南土著菌種的相關(guān)研究迄今尚未見報道。為此，本文試圖從海南熱帶海洋環(huán)境中篩選產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌并闡述其產(chǎn)酶條件，這對于應(yīng)用脂肪酶生物技術(shù)處理被油脂污染的熱帶海洋水體特別是熱帶養(yǎng)殖水體以及可持續(xù)發(fā)展熱帶海洋經(jīng)濟具有重大意義。
1材料與方法
1.1材料
樣品：從海南省樂東縣球港、陵水縣新村港、東方市板橋和三亞市南山等地的熱帶海水養(yǎng)殖環(huán)境中采集10份水樣。
主要試劑：蛋白胨、橄欖油（主要脂肪酸鏈長為C16-C18）、椰子油（主要脂肪酸鏈長為C8-C20）、葵花籽油（主要脂肪酸鏈長為C16-C22）、聚乙烯醇、蔗糖、4%聚乙烯醇（PVA）溶液、1 mg/mL羅丹明B溶液和橄欖油乳化液（4%PVA溶液：橄欖油=3:1，v/v）。
主要儀器：PCR儀；冷凍離心機；食品勻漿機；微生物快速立體計數(shù)儀；倒置熒光相差微分數(shù)碼顯微鏡。
1.2培養(yǎng)基
改良富集液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
改良羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO42g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂15 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min；滅菌后冷卻至60℃加入6 mL羅丹明B溶液。
改良復(fù)篩固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，瓊脂15 g/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
生長培養(yǎng)基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
計數(shù)固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5g/L，瓊脂15g/L，滅菌海水1L，pH7.0，121℃滅菌20min。
改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，橄欖油10g/L，pH7.0，滅菌海水定容至1L，pH7.0，121℃滅菌20 min。
1.3產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選
吸取10mL水樣至100mL滅菌海水中，180r/min、30℃振蕩10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、靜置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、30℃下培養(yǎng)。2 d后，吸取5 mL富集培養(yǎng)菌液至100 mL新鮮的富集液體培養(yǎng)基中，進行二次富集，如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次。吸取1 mL第3次富集培養(yǎng)菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-4；吸取100μL稀釋度為10-4的菌液在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上涂布，挑選在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上水解圈較大且在350 nm紫外燈下橙黃色熒光亮斑較大的菌落為篩選分離菌株。挑取菌落繼續(xù)于羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上重復(fù)3次劃線分離培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)一致。挑取羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上的單菌落至復(fù)篩固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至單菌落不再染上羅丹明B顯色劑。挑選在復(fù)篩固體培養(yǎng)基上的單菌落至改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于200 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)48 h，測定篩選得到菌株的產(chǎn)脂肪酶活性，以最優(yōu)產(chǎn)脂肪酶活性的菌株為目的菌株。
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