不同質(zhì)量濃度水飛薊賓對6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長抑制曲線（一）
摘要：目的探討水飛薊賓及同分異構(gòu)體的體外抗菌譜及水飛薊賓與臨床常用抗生素的聯(lián)合抑菌效應(yīng)。方法用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓及同分異構(gòu)體對臨床感染常見細(xì)菌的6種標(biāo)準(zhǔn)菌株和6種臨床分離菌株（74株）的最低抑菌濃度（MIC）。用平板菌落計(jì)數(shù)法測定不同質(zhì)量濃度水飛薊賓對6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長抑制曲線。
用棋盤微量肉湯稀釋法進(jìn)行水飛薊賓與臨床常用抗生素的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)（FIC），判定水飛薊賓與抗生素的聯(lián)合抑菌效應(yīng)。結(jié)果水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為50～400μg/mL，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC均＞400μg/mL；對表皮葡萄葡萄球菌臨床分離菌株的MIC分別為100、200、400、＞400μg/mL，對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌臨床分離菌株的MIC分別為400、＞400μg/mL；對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌臨床分離菌株的MIC均＞400μg/mL。水飛薊賓其他同分異構(gòu)體對6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為≥400μg/mL。水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長曲線都有明顯抑制作用，抑制效果隨藥物質(zhì)量濃度增加而增加，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長曲線無影響。水飛薊賓與青霉素/紅霉素聯(lián)用對革蘭陽性試驗(yàn)菌的FIC以0.5＜FIC≤1和1＜FIC≤2為主，水飛薊賓與環(huán)丙沙星或慶大霉素聯(lián)用對革蘭陰性試驗(yàn)菌的FIC以FIC＞2或1＜FIC≤2為主。結(jié)論水飛薊賓對革蘭陽性菌有較好的抑菌活性，其中對表皮葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng)。水飛薊賓的抑菌活性明顯高于其他同分異構(gòu)體。水飛薊賓與青霉素/紅霉素聯(lián)用主要為相加和無關(guān)作用，與環(huán)丙沙星或慶大霉素聯(lián)用主要為拮抗或無關(guān)作用。
隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性給臨床抗感染治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，已經(jīng)成為21世紀(jì)全球公共衛(wèi)生面臨的重大問題[1-5]。相比耐藥菌的迅速增加，近年來抗菌藥物的研發(fā)速度明顯減慢，未來臨床可能會出現(xiàn)無藥可用的局面。目前人們已將視線投向天然藥物[6]，中草藥因其來源廣泛、價(jià)廉、毒副作用小及不易出現(xiàn)耐藥性，而成為新抗菌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[7-8]。
中藥抑菌殺菌的有效成分多樣，包括有機(jī)酸、揮發(fā)油、生物堿、多糖類、黃酮類、萜類、醌類等，從植物花、葉、種子、果實(shí)、根、莖中提取的黃酮類化合物具有直接抑菌、協(xié)同抑菌及抑制細(xì)菌毒性等作用，其抑菌活性與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，自然界中不同來源及不同種類的黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)各異，抑菌譜和抑菌活性各不相同[9-11]。水飛薊種子皮的初級總提取物水飛薊素為黃酮本質(zhì)素類化合物，包括紫杉醇、紫杉醇衍生物、水飛薊亭、水飛薊寧、水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B和脫氫水飛薊賓9種成分，主要活性成分為水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧4種同分異構(gòu)體，其中水飛薊賓含量最高（60%～70%），并對金黃色葡萄球菌有抑制作用[12]。中藥成分復(fù)雜、作用機(jī)制廣泛，分離純化得到有效單體并研究其藥理作用是現(xiàn)代中藥開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前水飛薊賓作為保肝藥物廣泛應(yīng)用于臨床[13-14]。但關(guān)于水飛薊賓及同分異構(gòu)體的抑菌譜及其與抗生素聯(lián)合抑菌效應(yīng)的報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）和聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)，探討水飛薊賓及同分異構(gòu)體的抑菌譜及其與臨床常用抗生素的聯(lián)合抑菌效應(yīng)，為新抗菌藥物的開發(fā)和研制提供科學(xué)依據(jù)，為黃酮類藥物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
1、材料
1.1藥物與試劑
水飛薊賓（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號Y-024-150422）、水飛薊寧（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號S-112-170418）、異水飛薊賓（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號Y-138-161201）、水飛薊亭（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%，批號S-111-170418）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；青霉素、紅霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自中國食品藥品檢定研究院；M-H肉湯培養(yǎng)基粉末購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Costar®96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國Corning-Costar產(chǎn)品。
1.2菌株
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228、糞腸球菌ATCC29212、屎腸球菌ATCC19434、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心-菌種保藏中心。
1.2.2臨床分離菌株金黃色葡萄球菌15株、表皮葡萄球菌10株、糞腸球菌4株、屎腸球菌15株、大腸埃希菌15株、銅綠假單胞菌15株，均收集于四川省中醫(yī)院。
2、方法
2.1水飛薊賓及同分異構(gòu)體藥液配制
用二甲基亞砜將水飛薊賓及同分異構(gòu)體樣品溶解并配成80 mg/mL的母液，濾過除菌后4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r先用無菌MH肉湯將母液稀釋100倍，再用MH肉湯進(jìn)行倍比稀釋為800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL。
2.2抗生素溶液配制
用冰醋酸溶解紅霉素，用蒸餾水溶解青霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素，配成800μg/mL母液，濾過除菌后4℃保存?zhèn)溆茫褂脮r用無菌MH肉湯倍比稀釋。
2.3細(xì)菌懸液制備
將菌株復(fù)蘇于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個純菌落接種于無菌MH肉湯培養(yǎng)基中，37℃（100 r/min）振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌MH肉湯稀釋菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108 CFU/mL），再用MH肉湯調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×106～1.0×107 CFU/mL。
2.4 MIC測定
采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法測定各受試樣品的MIC。
2.4.1水飛薊賓及同分異構(gòu)體對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC測定取96孔板，每孔加入100μL菌懸液和100μL不同質(zhì)量濃度的供試藥液（水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧），使藥物終質(zhì)量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，37℃（100 r/min）振搖培養(yǎng)18～24 h，以肉眼觀察無細(xì)菌生長、培養(yǎng)液清澈的最低藥物質(zhì)量濃度為MIC。同時設(shè)陰性對照（無菌MH肉湯）和陽性對照（細(xì)菌＋無菌MH肉湯）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。
2.4.2水飛薊賓對臨床分離菌株的MIC測定按“2.4.1”項(xiàng)方法操作測定。
2.4.3抗生素對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的MIC測定革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌）選用青霉素、紅霉素，革蘭陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌）選用慶大霉素、環(huán)丙沙星。按“2.4.1”項(xiàng)方法操作測定。
2.5水飛薊賓對標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長抑制曲線檢測
取96孔板，每孔加入100μL菌懸液和100μL不同質(zhì)量濃度的水飛薊賓藥液，使水飛薊賓終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1 MIC、2 MIC；菌陽性對照組用無菌MH肉湯替代藥液（菌懸液＋無菌MH肉湯）。放37℃孵育箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16 h取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)（按國標(biāo)GB/T5750.12-2006）。將菌懸液按10倍遞增稀釋后，取目標(biāo)濃度菌懸液1 mL加入一次性無菌平皿，再加入15 mL 50℃左右營養(yǎng)瓊脂，立即混勻，待凝固后于37℃培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察并記錄每個平皿的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）。以菌落數(shù)為30～300的平板，計(jì)算每毫升原始樣品中所含細(xì)菌總數(shù)（1 mL原菌懸液中的活菌數(shù)＝全平板CFU×稀釋倍數(shù)），每個濃度菌液同時做3個平行平板，CFU取3個平板的均值。當(dāng)空白對照（只加無菌MH肉湯＋營養(yǎng)瓊脂，不加菌懸液）平板上無細(xì)菌生長時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。以菌落總數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪制生長抑制曲線。
2.6水飛薊賓與抗生素對標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株的聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)[15]
采用棋盤法。將水飛薊賓及臨床常用抗生素溶液（革蘭陽性菌選用青霉素和紅霉素，革蘭陰性菌選用慶大霉素和環(huán)丙沙星）以MH肉湯倍比稀釋成8個質(zhì)量濃度，即4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16 MIC、1/32MIC。聯(lián)合藥物孔將不同質(zhì)量濃度的水飛薊賓藥液與抗生素溶液兩兩組合加入96孔板，每種藥液每孔各加50μL；抗生素或水飛薊賓單藥孔加相應(yīng)單一藥液每孔100μL；細(xì)菌生長陽性對照每孔加無菌MH肉湯100μL。再向每孔加入100μL菌懸液，振搖混勻后37℃培養(yǎng)18～24 h。記錄抗生素單用MIC（MIC甲藥單用）、水飛薊賓單用（MIC乙藥單用）和抗生素與水飛薊賓聯(lián)合應(yīng)用MIC（MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用）。計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）＝MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。聯(lián)合抑菌效應(yīng)判定：FIC≤0.5，2種藥物有協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1，2種藥物有相加作用；1＜FIC≤2，2種藥物為無關(guān)作用；FIC＞2，2種藥物有拮抗作用。
2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分比表示。菌種間MIC值分布的總體比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用單因素方差分析。FIC值分布的比較采用獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用χ2分割法。
不同質(zhì)量濃度水飛薊賓對6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長抑制曲線（一）
不同質(zhì)量濃度水飛薊賓對6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長抑制曲線（二）
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