?食源性致病菌：微生物群體延滯期特點(diǎn)與測定方法
生長曲線群體生長延滯期的測定
目前微生物延滯期仍未基于微生物生長機(jī)理明確定義，生物學(xué)上被普遍接受的定義是：微生物群體經(jīng)歷環(huán)境突變，自我調(diào)整后開始繁殖的時(shí)間。幾何意義上微生物延滯期是指微生物對數(shù)生長期達(dá)到最大比生長速率時(shí)，生長曲線切線的反向延長線和初始菌量水平延長線的交點(diǎn)在時(shí)間軸上的投影點(diǎn)與零時(shí)刻的時(shí)間間隔。
基于微生物生長延滯期的測定方法，微生物群體延滯期需通過生長模型擬合生長曲線間接獲取。
微生物培養(yǎng)在延滯期有以下特點(diǎn)：
（1）細(xì)胞物質(zhì)開始增加；
（2）有的細(xì)胞因不適應(yīng)環(huán)境而死亡；
（3）微生物細(xì)胞總數(shù)有所下降；
（4）延滯期末期，細(xì)胞代謝活動(dòng)能力開始增強(qiáng)，并開始細(xì)胞分裂。
目前測定微生物生長曲線的方法主要分為傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法。表1中總結(jié)了應(yīng)用傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法測定微生物生長曲線進(jìn)而通過模型擬合獲取生長延滯期的相關(guān)研究。傳統(tǒng)測定微生物生長曲線的方法是活菌計(jì)數(shù)法，因其不受菌懸液顏色及濁度的影響而成為測定食品中食源性致病菌的主流手段。但是該方法操作繁瑣、耗時(shí)耗力，且應(yīng)用該方法獲取的生長參數(shù)準(zhǔn)確性與數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量及觀測點(diǎn)的位置均相關(guān)，因此活菌計(jì)數(shù)法還需進(jìn)一步改進(jìn)。相較于活菌計(jì)數(shù)法，比濁法因其操作簡便、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于微生物生長曲線的測定和建模研究中。然而，比濁法的檢測限僅能達(dá)到106～107CFU/mL，且只可用于液體培養(yǎng)基的測定，同時(shí)因測定的菌懸液濃度并不是活菌濃度而導(dǎo)致獲得的生長參數(shù)有些許誤差。建議今后的研究可基于技術(shù)層面對該方法進(jìn)行優(yōu)化，使其能更好地描述低濃度食源性致病菌的生長，為進(jìn)一步研究微生物生長提供依據(jù)。
表1應(yīng)用各種方法測定食源性致病菌生長曲線的相關(guān)研究
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)和PCR等分子生物學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用于微生物生長曲線的測定，相較于傳統(tǒng)方法，這些分子生物學(xué)技術(shù)具有省時(shí)省力、高效等優(yōu)點(diǎn)，且可同時(shí)測定兩種細(xì)菌的生長，極大地改善了傳統(tǒng)方法的不足。應(yīng)用DGGE結(jié)合PCR技術(shù)測定了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的生長情況，進(jìn)而通過Baranyi模型擬合其生長曲線獲取延滯期。傳統(tǒng)PCR技術(shù)需結(jié)合DGGE技術(shù)才可定量測定微生物的生長情況，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了其缺陷，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的突破。將金黃色葡萄球菌的菌液接種于豬肉中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間提取生長后細(xì)菌的總基因組DNA，并對其進(jìn)行qPCR分析，進(jìn)而根據(jù)已建立的微生物濃度與qPCR的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量描述豬肉中金黃色葡萄球菌的生長情況，最后應(yīng)用模型擬合其生長曲線，間接獲取生長延滯期。同樣應(yīng)用qPCR技術(shù)分別定量描述了豬肉中單增李斯特菌和即食南美白對蝦中副溶血性弧菌的生長情況，并對其進(jìn)行模型擬合，獲取了延滯期。但因qPCR技術(shù)無法區(qū)分活菌和死菌，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差?；诖?，將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與多重qPCR技術(shù)相結(jié)合，極好地定量描述了生鮮南美白對蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌的生長行為。雖然PMA的應(yīng)用可區(qū)分活死菌，但其會(huì)對細(xì)菌產(chǎn)生一定的損傷。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為預(yù)測微生物學(xué)注入了新的活力，加速了預(yù)測微生物學(xué)的發(fā)展。然而，任何方法均需辯證地看待，即每一種方法均各有優(yōu)點(diǎn)和局限性，因此分子生物學(xué)技術(shù)并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍需根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)方法。
綜上所述，雖然微生物群體延滯期和單細(xì)胞延滯期均可采用上述方法間接獲得，但是微生物群體延滯期會(huì)因擬合模型不同而不同，同時(shí)微生物單細(xì)胞生長觀測方法依然存在精度低、控制難、耗時(shí)長等問題。
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