結核分枝桿菌藥物敏感性試驗：細菌計數儀VS磨菌瓶，哪個更好用
目的：評估細菌超聲分散計數儀（簡稱“細菌計數儀”）在結核分枝桿菌藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗”）中的生物安全優勢。方法：使用細菌計數儀和磨菌瓶兩種方法對結核分枝桿菌做藥敏試驗，操作過程中在安全柜內用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集空氣，接種中性羅氏培養基，培養后觀察菌落生長情況。
結果：細菌計數儀操作過程中，空氣采樣培養后無菌落生長，磨菌瓶操作過程中，空氣采樣培養后有少量菌落生長。結論：在分枝桿菌藥敏試驗的菌懸液制備過程中，對比傳統磨菌瓶處理方法，細菌計數儀處理能更快、操作時間短，使用菌量更少，靜置同樣時間開蓋后產生氣溶膠含菌量低。大大降低了結核藥敏試驗這種大量活菌操作試驗給操作者和環境帶來的生物安全隱患，同時不影響菌株的活性和藥敏試驗結果。
結核分枝桿菌（MTB）的藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗”）是耐藥結核病診斷的金標準。目前在我國各級結核病診斷實驗室中，最常用的耐藥檢測方法仍然是基于固體培養基培養的比例法和MGIT 960的液體比例法，而菌懸液標本的制備是其關鍵步驟。常用的方法是磨菌瓶法：通過振蕩瓶中的玻璃珠與菌落，從而使菌落分散，然后加入含0.5%Tween-80的生理鹽水進行稀釋，與麥氏1號標準比濁管或比濁儀比濁并稀釋至1個麥氏濁度（MCF），經稀釋后接種到含藥羅氏管進行耐藥性檢測。上述方法雖然能使菌落分散成菌體，成功完成藥敏檢測，但存在操作繁鎖、耗時長、比濁粗糙，用菌量大，以及生物安全風險等問題。而細菌超聲分散計數儀采用超聲分散的原理使菌落分散，同時自動檢測濁度，最后經人工接種到含藥培養管培養進行耐藥性檢測，具有操作簡單、減少開蓋次數、標準化，耗時短，用菌量少，減少生物安全風險等優勢。
本研究分別采用細菌超聲分散計數儀（簡稱“細菌計數儀”）和傳統的研磨瓶法制備臨床MTB菌株的菌懸液樣本，制作過程中采集空氣樣本培養，以評估細菌計數儀在MTB藥敏試驗中的生物安全優勢。
1.材料與方法
1.1一般材料
菌株來源：實驗中所用的菌株為本實驗室耐多藥可疑者篩查項目菌株，傳代后5周。狀態最好時期。
儀器與試劑：①儀器：細菌超聲分散計數儀（超聲功率為19W；廣東體必康生物科技有限公司生產）、37°C恒溫培養箱、生物安全柜、FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器，微量震蕩器。②試劑耗材：磨菌瓶、羅氏中性培養基、接種環、生理鹽水、0.5%Tween-80生理鹽水、超聲分散專用試管。
1.2方法
磨菌瓶法菌懸液制備：用一次性10μL接種環挑取羅氏培養基內菌落約一環，放入磨菌瓶中，擰緊瓶蓋，在震蕩器上震蕩30s，震蕩過程中調整磨菌瓶角度，使玻璃珠在磨菌瓶內轉動。震蕩后靜置15min，靜置后開蓋加入適量生理鹽水（此步驟開始使用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集生物安全柜內空氣樣品），比濁儀比濁，按照比濁儀提示稀釋至1MCF（1mg/mL）。結束空氣采樣，將采樣膜處理后，用無菌尼龍拭子涂抹于中性羅氏培養基表面，放入37°C溫箱培養。
細菌計數儀法菌懸液制備：用一次性10μL接種環挑取羅氏培養基內菌落約四分之一環，放入預先加有2mL生理鹽水的超聲分散專用試管中，然后將該試管放入細菌計數儀中進行超聲分散：超聲5s，間隔5s，持續1min。取出后靜置15min，根據儀器提示加入相應體積稀釋液（此步驟開始使用FA-2型撞擊式空氣微生物采樣器采集生物安全柜內空氣樣品），將菌懸液稀釋至1MCF（1mg/mL）。結束空氣采樣，將采樣膜處理后，用無菌尼龍拭子涂抹于中性羅氏培養基表面，放入37°C溫箱培養。
2.結果
使用磨菌瓶法制備7份菌懸液，用時1h，采樣時間20min，接種10支羅氏中性培養基，使用細菌計數儀法制備制備7份菌懸液，用時30min，采樣時間20min，接種10支羅氏中性培養基。經過37°C培養8周，結果見表1。
表1.兩種方法制備菌懸液培養基陽性及菌落數比較(n)
3.討論
人及動物結核病的病原菌是結核分枝桿菌（TB），發病率最高的是以人型結核分枝桿菌，約占百分之九十，接下來接是牛型，其他分枝桿菌所致感染非常少見。近年來國內有不少有關生物安全防護、生物安全管理、防護設備調查的實驗室生物安全問題發生，越來越引起人們的重視。一般涉及MTB生物安全的文獻較少，缺乏相應的實驗數據支持，主要為說明操作規范的標準操作程序。難以避免產生氣溶膠在日常檢測MTB的實驗活動中，如痰樣本混勻、離心、開啟培養皿和安瓿，樣本涂片、意外事件如培養物的濺出和潑灑、培養液的傾倒和轉移、離心管破碎等都可造成嚴重污染。主要原因是因為大部分實驗室感染人員在處理臨床樣本和培養物過程中吸入產生的含病原體的氣溶膠所致。醫務人員存在較高的感染風險，在結核病患者較多活動的醫療衛生單位。結核防治工作人員結核病發病水平顯著高于一般人群。長期以來，我國各級實驗室通常采用手工磨菌、人工比濁的方法對MTB進行研磨分散與比濁稀釋后進行比例法或絕對濃度法的藥敏試驗。手工磨菌過程容易產生可開放擴散的氣溶膠，且研磨過程中存在液體迸濺的風險，即使在生物安全柜內進行磨菌操作，手工磨菌的過程仍然存在較大的生物安全隱患。因此，在傳統藥敏試驗的前期菌懸液制備階段，通過細菌計數儀來代替傳統磨菌瓶研磨處理，處理能力更快、操作時間短，使用菌量更少，靜置同樣時間開蓋后產生氣溶膠含菌量低。大大降低了結核藥敏試驗這種大量活菌操作試驗，給操作者和環境帶來的生物安全隱患。同時不影響菌株的活性和藥敏試驗結果。
細菌超聲分散計數儀可以用于結核分枝桿菌等微生物藥敏試驗的菌懸液制備、細菌分離培養的菌落分散及濁度評測、以及菌種鑒定、菌種保藏的樣品前處理等。在超聲波的作用下，超聲分散專用試管中的微小氣泡核會產生振動，當聲壓達到一定值時，氣泡將迅速膨脹，然后突然閉合，在氣泡閉合時產生沖擊波。細菌超聲分散計數儀的分散功能就是利用這種超聲空化作用，完成對結團性細菌的分散。細菌超聲儀利用90°散射光特性，即不論光源波長和待檢測細菌直徑大小關系如何，在菌液濃度一定時，90°方向上散射光強度保持恒定。再利用光傳感器把光信號轉化為電信號，最終使菌液濃度以麥氏濁度的方式呈現在系統里。在結核菌的藥敏試驗中，常規方法受到結核菌成團性以及氣溶膠生物安全隱患的影響，在試劑操作中存在著極大的不便，而細菌超聲細菌計數儀不僅可以完成菌團的分散，而且對菌液的濃度進行了檢測，為實驗人員提供了安全、高效和標準化的結核菌操作方案。
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