柑桔砂皮病菌座殼菌生長條件及納米藥劑篩選（二）
2結(jié)果與分析
2.1病原菌分離與鑒定
2.1.1形態(tài)學鑒定從采集病樣中,分離和純化培養(yǎng)獲得3個分離物,分別接種于PDA上24℃培養(yǎng),觀察病菌形態(tài)特征和分生孢子。其中,S2菌株的菌落白色,有花瓣狀輪紋,氣生菌絲與培養(yǎng)基上菌絲較為發(fā)達,未產(chǎn)生分生孢子。應用菌餅接種法接種分離菌株于刺傷柑桔果實上,S2菌株可產(chǎn)生明顯的砂皮病癥狀,且從發(fā)病組織上再分離得到的菌與接種菌相同(見圖1)。
圖1柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)及菌落形態(tài)
2.1.2分子鑒定利用rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對,結(jié)果顯示S2菌株與Diaporthecitriasiana(KJ490616.1、MN816406.1)的同源性為100%。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示,S2菌株與Diaporthecitriasiana(亞洲柑桔間座殼)聚類到一起,形成明顯分支(圖2)。
綜合菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和rDNA-ITS序列比對結(jié)果,將S2菌株鑒定為Diaporthecitriasiana。
2.2病菌生物學特性
2.2.1培養(yǎng)基的影響試驗結(jié)果看出,S2菌株在4種供試培養(yǎng)基上均能生長,但菌絲形態(tài)和擴展速度存在差異。在OA上,菌落白色,邊緣棉絮狀,無輪紋,菌絲稀薄,菌絲擴展速度最快,培養(yǎng)7 d,菌落直徑達到55.50 mm。在CA上,菌落灰色,邊緣白色、棉絮狀,具花瓣狀輪紋,菌絲旺盛,菌絲擴展速度最慢,培養(yǎng)7 d菌落直徑為44.05 mm。在PDA上,菌落白色,邊緣規(guī)則,具花瓣狀輪紋,菌絲旺盛,培養(yǎng)7 d菌落直徑54.80 mm。在PSA上,菌落中心棕色,邊緣棉絮狀,無輪紋,菌絲稀薄,培養(yǎng)7 d菌落直徑52.33 mm(見圖3)。
圖2柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)
2.2.2碳源的影響在不同碳源Czapek培養(yǎng)基上,S2菌株均能生長,但菌落形態(tài)和菌絲擴展速率存在差異。碳源為可溶性淀粉時培養(yǎng)10 d的菌落直徑63.50 mm,碳源為蔗糖處理時培養(yǎng)10 d的菌落直徑僅44.75 mm,兩者差異顯著(見圖4)。
圖4柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同碳源Czapek培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的菌落形態(tài)
2.2.3氮源的影響在不同氮源Czapek培養(yǎng)基上,S2菌株均能生長,但菌絲擴展速率存在差異。氮源為蛋白胨時培養(yǎng)10 d的菌落直徑達到70.40 mm,氮源為氯化銨時培養(yǎng)10 d的菌落直徑僅33.3 mm,兩者差異顯著(見圖5)。
注:賴氨酸氮源處理培養(yǎng)基呈黃色,未接種菌株前即呈黃色。
2.2.4光照的影響不同光照條件下,S2菌株菌絲擴展速率存在差異。在全光照條件下,菌絲擴展速度最快,培養(yǎng)10 d的菌落直徑80.60 mm;在光暗交替條件下,菌絲擴展速度最慢,培養(yǎng)10 d的菌落直徑77.30 mm(見圖6)。
圖6柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養(yǎng)基上不同光照條件培養(yǎng)10 d的菌落形態(tài)
2.2.5溫度和pH值的影響S2菌株在15～30℃范圍內(nèi)均能生長,35℃時不能生長,最適合生長的溫度為20～30℃(見圖7)。S2菌株在pH值5～9范圍內(nèi)均能生長,最適合生長的pH值范圍為5～7。
2.2殺菌劑和納米試劑的室內(nèi)毒力
3種殺菌劑對S2菌株的抑制作用強,EC50值為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC<32%噻呋·氟環(huán)唑SC<430 g/L戊唑醇SC,抑制效果為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC>32%噻呋·氟環(huán)唑SC>430 g/L戊唑醇SC。3種納米試劑對S2菌株的抑制作用較強,且同種試劑濃度越高,菌落直徑越小,抑制率越高。在納米試劑中,SiO2納米試劑的毒力最強,EC50為1.024μg/mL;星狀陽離子聚合物(SPc)納米載體的毒力最弱,EC50為6.928μg/mL。
3討論與結(jié)論
前人研究表明,不同地域條件對病原菌的生物學特性基本無顯著影響,而相同菌株在不同培養(yǎng)條件下的生物學特性存在差異。本研究分離鑒定獲得的柑桔砂皮病菌S2菌株,在不同培養(yǎng)條件下的生物學特性與前人研究結(jié)果基本一致。該菌株對甘油、麥芽糖和可溶性淀粉等碳源的利用效果較佳,菌絲擴展速度最快;對蛋白胨氮源的利用效果最好;在15～30℃均能生長,最適生長溫度為20～30℃,致死溫度為35℃;pH值5～9均能生長,最適pH值為5～7;光暗交替培養(yǎng)時,菌落才出現(xiàn)花瓣狀輪紋。
室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明,3種殺菌劑對柑桔砂皮病菌S2菌株的抑制作用強,與前人研究結(jié)果一致,其中,40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC抑制作用最強,EC50值為1.024μg/mL。供試納米試劑對柑桔砂皮病菌S2菌株均具有較強抑制作用,抑制效果為SiO2納米試劑>土霉素碳量子點納米試劑>星狀陽離子聚合物(SPc)納米載體。SPc納米載體具有高效、簡便及安全的納米傳遞系統(tǒng),可有效提升藥劑活性,在本試驗中SPc納米載體單獨使用即可達到較好的抑制效果,EC50為6.928μg/mL,后期結(jié)合篩選出的化學藥劑,提升效果的潛力巨大,但有待于進一步驗證。國內(nèi)目前針對柑桔砂皮病菌,室內(nèi)篩選出的殺菌劑以苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、代森錳鋅等殺菌劑為主,EC50范圍為0.099～0.950μg/mL,殺菌效果顯著。測定了33種殺菌劑對柑桔砂皮病菌的毒力,表明雙胍三辛烷基苯磺酸鹽毒力最強(EC50為0.011 2μg/mL),氟硅唑、多菌靈、咪鮮胺錳鹽、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、唑醚·代森聯(lián)、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇的毒力較強(EC50均在1μg/mL以下),并推薦田間以使用氟硅唑和多菌靈為主防控柑桔砂皮病。田間防控砂皮病發(fā)現(xiàn),代森錳鋅等保護性殺菌劑具較好防效,但需連續(xù)多次施藥才能達防控效果,人工成本和用藥成本高,且易造成環(huán)境污染。將礦物油等增效劑與農(nóng)藥聯(lián)用可以增加農(nóng)藥黏性,增強藥效,達到減量增效的目的。納米材料具有小尺寸效應、大比表面積、高反應活性、量子效應等理化特性,這些特性使得納米材料應用于農(nóng)藥時,能提高農(nóng)藥對生物靶標表面的黏附性和滲透性,減少流失和分解,控制農(nóng)藥釋放速度,延長農(nóng)藥持效性,提高農(nóng)藥利用率。目前在我國還未見關于納米農(nóng)藥用于柑桔砂皮病防控的報道。本試驗篩選的3種納米試劑對柑桔砂皮病菌都表現(xiàn)出較強的抑制作用,為納米農(nóng)藥用于柑桔砂皮病的防控提供了依據(jù)。
在本研究中,未能測定柑桔砂皮病菌S2菌株的產(chǎn)孢時間及產(chǎn)孢量,也未涉及納米試劑與農(nóng)藥混合使用的效果及納米試劑對農(nóng)藥藥效的影響等內(nèi)容。這有待于進一步研究。
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