基于微生物生長曲線測定儀研發導管尖端的自動化培養鑒定方法
留置血管內導管是為患者實施診療時常用的醫療操作技術。隨著各種導管在臨床廣泛的應用，導管相關的感染也越來越多。血管導管相關感染(Vessel CatheterAssociated Infection，簡稱VCAI)是指留置血管導管期間及拔除血管導管后48小時內發生的原發性、且與其他部位感染無關的感染，包括血管導管相關局部感染和血流感染。目前臨床常用的導管的類型包括中心靜脈導管、PICC、臍血管導管、完全植入式靜脈輸液港、血液透析導管、外周動脈導管、漂浮式肺動脈導管等。這些導管的植入是一種侵襲性操作，操作過程中污染，護理不當，放置的時間過長、菌血癥等原因都會引起導管相關感染。
據報道，聚氯乙烯、硅膠制品等導管可以粘附大量微生物，從而增加感染幾率。隨著導管留置時間延長，導管在其內的留置會使血液中的纖維蛋白及血清蛋白沉淀聚集在導管表面，反而起到了保護病原體的作用。綜上，病原體可沿導管表面向體內蔓延生長，繁殖到一定數量時釋放人血就會出現菌血癥、敗血癥的相關臨床癥狀，有感染導致休克死亡的風險。因此，及時確定是否血管導管相關感染并快速選擇合理有效的抗感染藥物是治療成功的關鍵。
為明確導管相關感染，需要進行導管尖端培養以明確診斷，鑒別致病菌。目前常見的檢測方法包括以下步驟：1)用無菌剪刀剪下導管尖端，2)將剪下的導管尖端放在無菌容器中送至專業微生物檢驗實驗室，3)在實驗室內將待測導管尖端在血平皿上作滾動涂布接種，4)將血平皿在恒溫培養箱中培養約20h，5)取出血平皿通過觀察有無菌斑來判斷該導管尖端外部是否被可培養細菌污染。如果需要檢測導管尖端內部是否被污染，則需要采用超聲震蕩無菌生理鹽水沖洗導管尖端，然后將沖洗水涂在血平皿上接種，再進行其它的操作步驟。目前檢測導管及導管尖端是否被病原體污染的主要問題有四個，一是即使有細菌粘附污染，在接種時也不一定能(全部)從待測導管尖端上脫離并接種到血平皿上，因而易造成假陰性誤判；二是操作繁瑣，結果嚴重依賴微生物檢驗專業操作人員的個人技能；三是周期長，效率低，培養結果在72小時后才能反饋給臨床；這導致針對致病菌的針對性治療延后了至少72小時。四是致病原鑒定無法在床旁等現場實施。
目前醫療行業急需簡便高效、快速準確檢測導管相關感染及床旁快速藥敏試驗的新技術。
導管尖端的自動化培養鑒定步驟：
步驟1：一次性檢測管中預裝入蛋白胨水，將待測導管尖加入到所述一次性檢測管中，將一次性檢測管封口；
步驟2：然后將一次性檢測管插入微生物生長曲線自動化測定儀器中的檢測通道；
步驟3：通過微生物生長曲線自動化測定儀器測定的細菌生長曲線形狀判斷目標導管尖是否有細菌或真菌定植
采用八通道電容耦合非接觸式電導率檢測器作為傳感單元，采用一對同軸銅氣缸作為致動器電極和拾取電極，構成電容耦合的非接觸式電導率檢測器的工作通道。在將充滿含有導管尖的培養液試管插入工作通道后，將交流電壓施加到致動器電極上，以電容耦合到水介質中。致動器電極和拾取電極與絕緣管和介質形成兩個耦合電容(Cw)。損耗電容(Cs)產生于兩個電極通過空氣(Cs)之間的直接電容耦合。該水介質相當于一個電阻器接收站。介質的表觀電導率(直流電壓信號)在拾取電極上獲得；其大小與水介質中離子載流子的濃度和遷移率成正比。如果導管尖存在細菌或者真菌，細菌或真菌細胞將在所需的溫度下增殖和生長。細菌的生長轉化了不帶電或弱帶電的底物，酵母、肽和糖轉化成高電荷的最終產物，如氨基酸、醛、酮、酸等代謝物，提高水介質的電導率。通過電容耦合的非接觸式電導率檢測器，每間隔30秒自動在線收集水介質的表觀電導率。由于電導率的變化而不是絕對值與細菌生長的動力學過程成正比，我們使用算法計算每個試管中水介質的電導率變化值(即歸一化表觀電導率值NACV)如下：
NACVn＝ACVn-ACV0
式中，NACVn為n點收集的實時NACV；ACVn為n點收集的表觀電導率值；ACV0為孵育開始時收集的初始表觀電導率值。然后通過繪制NACVs為孵育時間的函數來生成s型CCS生長曲線。當導管尖沒有任何細菌真菌時，生長曲線為一條直線(沒有s型CCS生長曲線)。
細菌或者真菌在生長代謝的過程將分解導電性較差的有機大分子物質，生成導電性較好的小分子物質和離子，造成混合體系導電能力的增加，即混合體系電導C值的增加。這種電導的增加過程可以通過電子微生物生長分析儀實時在線監測并生成C-t曲線。從電子微生物生長分析儀自動報告的細菌生長C-t曲線形狀直接讀出定性檢測結果：正峰，且電導率值(NACV)＆gt;0.02V，說明目標細菌或菌群生長；水平線，說明細菌沒有生長。
快速藥敏試驗為頭孢他啶管和頭孢他啶-克拉維酸管在培養45000s內，兩管電導率值差值(NACV’)＆gt;0.02V。
導管尖端的自動化培養鑒定方法工作過程為：
將從臨床送檢的導管尖端放置到預先裝滿蛋白胨水的專用檢測管中，將檢測管封口后插入電子微生物生長分析儀，電子微生物生長分析儀全自動在線監測并繪制出非接觸電導(C)-時間(t)曲線。從電子微生物生長分析儀自動報告的細菌生長曲線形狀直接讀出結果(培養45000s內)：電導率值(NACV)＆gt;0.02V，說明導管尖存在細菌或真菌；電導率值(NACV)＆lt;0.02V或水平線，說明沒有細菌或真菌生長。細菌的生長代謝過程由電子微生物生長分析儀全自動在線監測并繪制出非接觸電導(C)-時間(t)曲線。測定結束后根據C-t曲線的形狀及電導率值判斷導管尖是否有細菌生長。
測定金黃色葡萄球菌(ATCC25923)標準菌株在導管尖內定植能否被檢測。
步驟一、啟動電子微生物生長分析儀(ER832型，澳大利亞eDAQ公司產品)和專用計算機。在檢測軟件窗口設置溫度、采集頻率、采集次數、激勵頻率和激勵強度參數分別為38℃、1分鐘/次、1200次、30KHz和80％，預熱10分鐘，待用。
步驟二、采用單通道移液器(大龍公司產品，量程為0-200μL)將含107
CFU/mL金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的200μL LB液體培養基打入導管尖中，將導管尖放入已經預裝有2mL蛋白胨水(廣州迪景微生物科技有限公司)的一次性檢測管(青島谷峰實驗儀器有限公司產品，U型，材質為聚丙烯，外徑5mm，內徑4.5mm，管長170mm)，然后采用無菌膠塞封住管口。同樣，將200μL無菌LB液體培養基打入導管尖中，將導管尖放入已經預裝有2mL蛋白胨水的一次性檢測管并封口，作為陰性對照；
步驟三、將上述兩個檢測管分別插入電子微生物生長分析儀的檢測通道，并開始測定細菌C-t曲線。
步驟四、對應于待測金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和陰性對照的C-t曲線如圖1所示。其中陰性對應一條直線，說明檢測體系未被污染。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)對應一條正峰(即細菌生長代謝且結果造成血液電導增加)，說明體系中細菌能夠正常生長代謝。
測定肺炎克雷伯菌(ATCC700603)標準菌株快速藥敏試驗。
步驟一、同實施例1步驟一。
步驟二、采用單通道移液器將含肺炎克雷伯菌(ATCC700603)待測菌株107
CFU/mL200uL打入兩個導管尖中，將含有待測菌株的導管尖所在的蛋白胨水作為待測液分別加入已經預裝含有頭孢他啶(16mg/L)、頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)的蛋白胨水中的一次性檢測管，然后采用無菌膠塞封住管口。同樣，將200μL超純水轉入一個同樣已經預裝有蛋白胨水的檢測管并封口，作為陰性對照；頭孢他啶-克拉維酸管與頭孢他啶管比較，可初步判斷是否產超廣譜內酰胺酶。
步驟三、將上述三個檢測管分別插入電子微生物生長分析儀的一個檢測通道，并開始測定細菌C-t曲線。
步驟四、對應陰性對照、含有頭孢他啶(16mg/L)、頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)的蛋白胨水的C-t曲線如圖2所示。其中陰性對應一條直線，說明檢測體系未被污染。含有頭孢他啶(16mg/L)比頭孢他啶-克拉維酸(16/4mg/L)在培養45000s內，兩管電導率值差值(NACV’)＆gt;0.02V。說明體系中細菌能夠正常生長代謝且產生超廣譜β內酰胺酶(即具有耐藥性)。通過是否產生超廣譜β內酰胺酶判斷細菌是否具有耐藥性。
超廣譜β內酰胺酶(ESBL)是一類能水解青霉素類，頭孢菌素類以及單環類抗生素的β-內胺酶，其活性能被某些B-內酷胺酶抑制劑抑制。能產生ESBL的細菌即為ESBL(+)菌，可對上述多種抗生素產生耐藥；
肺炎克雷伯菌為一種革蘭氏陰性桿菌，其最重要的耐藥機制是產生超廣譜β-內酰胺酶；
頭孢他啶-克拉維酸(頭孢他啶與克拉維酸聯用)的原因：革蘭氏陰性桿菌產生的超廣譜β內酰胺酶的活性可以被β內酰胺酶抑制劑，比如克拉維酸所抑制。