瘢痕疙瘩MSCs生長曲線與發(fā)病機制研究（一）
目的探索獲得瘢痕疙瘩來源的高純度間充質(zhì)干細胞(MSCs)的培養(yǎng)方法。方法來源于第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者的瘢痕疙瘩標本，所取病變部位均位于前胸及后背皮膚，采用DMEM∶F12/(100 mL/L)胎牛血清(FBS)初步培養(yǎng)，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培養(yǎng)，接著用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養(yǎng)，最后用無血清的干細胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)，并通過觀察細胞形態(tài)特征及應用流式細胞術檢測細胞表面標記物的表達情況進行鑒定。結果經(jīng)血清梯度培養(yǎng)后得到了長梭形、形態(tài)均一，純度較高的纖維樣細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測后細胞表面標記物表達情況為：CD29為99.99%，CD44為99.7%，CD45為0.69%，CD73為99.96%。結論血清濃度逐漸降低的梯度培養(yǎng)法可獲得高純度的瘢痕疙瘩MSCs。
瘢痕分為生理性瘢痕和病理性瘢痕，而病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩主要由局部創(chuàng)傷和表皮異位等造成真皮損失和膠原的異常聚集所致，在臨床上表現(xiàn)為呈“蟹足樣”浸潤性生長[1]。一般不自行萎縮，切除后易于復發(fā)，但一般不會發(fā)生轉移和惡變[2]。目前瘢痕疙瘩的發(fā)病機制不清，也無理想的治療方法[3]。而間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細胞，目前已經(jīng)從骨髓、骨膜、皮膚等組織處分離得到MSCs[4]。有報道表明，瘢痕疙瘩中MSCs的數(shù)量要比正常皮膚中的多[5]，但是其作用機制尚不明確。因此，對MSCs的研究成為瘢痕疙瘩發(fā)病機制研究的一個重要方面。目前對于瘢痕疙瘩MSCs的分離培養(yǎng)一般借鑒正常皮膚MSCs的培養(yǎng)方法，但一般培養(yǎng)周期長，和成纖維細胞呈混雜生長，難以分離出純度高的干細胞。因此，探討瘢痕疙瘩MSCs的培養(yǎng)方法對瘢痕疙瘩發(fā)病機制的研究具有重要的意義。
1材料與方法
1.1標本來源瘢痕疙瘩標本來源于第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者，患者均為初次就診，此前未接受過其他治療，無全身其他器質(zhì)性疾病，病變部位均位于前胸及后背。經(jīng)患者知情同意后，以手術及電子線照射治療瘢痕疙瘩病變，同時經(jīng)病理診斷確診為瘢痕疙瘩，留取標本備用。
1.2主要試劑及儀器2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon)，胎牛血清(FBS，Gibco)，干細胞培養(yǎng)基(Cell Therapy Systems STEMPRO MSC SFM CTSTM,Gibco)，Ⅱ型中性蛋白酶(DispaseⅡ,Roche)，CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE、CD73-APC(eBioScience)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。
1.3 MSCs原代分離用生理鹽水將瘢痕疙瘩標本帶回實驗室，并用生理鹽水涮洗3次，采用RIEKSTINA等[6]報道的正常皮膚MSCs的分離方法，將瘢痕疙瘩組織塊剪成條索狀，用25 g/LⅡ型中性蛋白酶37℃孵育2 h，在無菌條件下用鑷子輕輕撕去表皮，留下真皮。再將樣本剪成1 mm3大小的組織塊，D-Hanks緩沖液洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min，加入含有100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復吹打乳糜狀組織塊使細胞分離，通過孔徑40μm的細胞濾網(wǎng)過濾，濾液離心棄上清，加入含100 mL/L FBS和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，轉移到細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。
1.4 MSCs的培養(yǎng)及顯微鏡下的形態(tài)觀察采用CARLSON等[7]關于小鼠心肌MSCs的培養(yǎng)方法，用含100 mL/L FBS和1%雙抗的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，37℃、50 mL/L CO2條件下孵箱，10 d后改為含100 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，使MSC富集；再改用含10 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，直到長梭形的細胞成為優(yōu)勢細胞；最后用含1 g/L的poly-D-賴氨酸的無血清干細胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)細胞[含低糖DMEM∶Ham’s F12(1∶1)、B27、抗生素、20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-2、10 ng/mL LIF]，直到細胞完全融合后胰酶消化傳代。
1.5 MSCs表面標志的鑒定取第3代貼壁細胞，胰蛋白酶37℃消化2 min，用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心、棄上清液，加入PBS制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，PBS洗滌、離心后加入95μL的PBS重新懸浮細胞，分別滴加5μL的CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE和CD73-APC 4種熒光抗體，冰上避光孵育30 min，以1 000 r/min離心5 min，棄去含熒光抗體的PBS，再用PBS洗滌2次，除去未結合的熒光抗體。向細胞中加入500μL預冷的PBS，吹打混勻，轉移至流式管中，同時以未被抗體處理的MSCs作為陰性對照，上流式細胞儀進行檢測。
1.6觀察MSCs生長并繪制生長曲線取第3代細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后第1、2、3、4、5、6、7、8 d采用錐蟲藍染色，計數(shù)活細胞并繪制生長曲線。
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