不同代次改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果比較
為探究改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌CVCC2960滑液支原體(以下簡(jiǎn)稱MS)生長(zhǎng)規(guī)律，本試驗(yàn)首次同時(shí)采用CFU計(jì)數(shù)、CCU測(cè)定和pH值測(cè)定的方法，比較不同接種濃度、接種體積和不同代次MS生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：5%與10%接種量的CCU測(cè)定結(jié)果峰值差異不明顯，但5%接種的CFU計(jì)數(shù)峰值更高，pH下降更慢；1～5代菌在生長(zhǎng)曲線各階段的測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯差別；3種不同接種方式的測(cè)定結(jié)果顯示，用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養(yǎng)基的方式更利于MS生長(zhǎng)。本試驗(yàn)為改良Frey氏液體培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。
支原體污染是生物制品常見(jiàn)的污染源，給科研、疫苗生產(chǎn)及生物制品產(chǎn)業(yè)帶來(lái)許多麻煩，《美國(guó)藥典》、《歐洲藥典》及《中國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部中均有使用培養(yǎng)法進(jìn)行生物制品支原體檢查的專題論述[1-3]，《中國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定滑液支原體、豬鼻支原體分別為支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基支原體改良Frey氏培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基質(zhì)控菌株[3]。通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU，繪制出的MS生長(zhǎng)曲線表明：其遲緩期為培養(yǎng)后6 h內(nèi)，對(duì)數(shù)期為6～36 h，穩(wěn)定期為36～54 h，衰老期為54 h之后[4]。而通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU可以發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)過(guò)程中活菌濃度上升伴隨著pH值的降低，且pH值為6.9時(shí)濃度達(dá)到最高[5],但同時(shí)用以上三種方法對(duì)滑液支原體進(jìn)行生長(zhǎng)曲線研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)合CFU計(jì)數(shù)法、CCU測(cè)定法和pH值測(cè)定法，以活菌濃度、生長(zhǎng)滴度和菌液pH值為指標(biāo)，比較不同接種濃度、體積和不同代次MS生長(zhǎng)情況，對(duì)該MS生長(zhǎng)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控工作的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。
不同接種濃度和收獲時(shí)間差異比較
不同接種濃度活菌濃度和pH值的比較兩種濃度接種的MS各時(shí)間點(diǎn)的活菌濃度、生長(zhǎng)滴度和pH值如表1、表2所示。從表1可以看出，5%濃度接種的MS接種后24 h活菌濃度達(dá)到峰值；生長(zhǎng)滴度18 h達(dá)到峰值；菌液pH則持續(xù)下降，18～24 h降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的MS活菌濃度24 h達(dá)到峰值；生長(zhǎng)滴度18 h達(dá)到峰值；菌液pH持續(xù)下降，18～24 h降至7.0以下。
不同接種濃度生長(zhǎng)曲線和pH值變化
比較兩種接種濃度MS生長(zhǎng)曲線和pH值變化情況見(jiàn)圖1～圖3。從圖1可以看出，接種濃度5%的MS 6～18 h活菌濃度增長(zhǎng)更快，18～30 h活菌濃度更高；從圖2可以看出，接種濃度10%的MS 18～24 h生長(zhǎng)滴度更高，24～40 h生長(zhǎng)滴度下降更快；從圖3可以看出，同為pH持續(xù)下降的情況下，10%下降更快。
滑液支原體1～5代菌生長(zhǎng)滴度比較
1～5代菌0～40 h各時(shí)間生長(zhǎng)滴度見(jiàn)表3，F(xiàn)1～F5分別表示1～5代菌，其生長(zhǎng)滴度變化范圍從低代至高代依次為(105～108)、(106～5.5×108)、(106～109)、(106～5.5×108)、(106～109)CCU/mL、通過(guò)比較1～5代MS生長(zhǎng)滴度差異(表4、圖4)，可以看出1～5代菌峰值均不小于1.00×108CCU/mL，其中，F(xiàn)3、F5峰值達(dá)1.00×109CCU/mL，1～5代菌生長(zhǎng)滴度不小于1.00×108CCU/mL的生長(zhǎng)時(shí)間區(qū)段重疊部分為24～30 h。
圖2不同接種濃度滑液支原體生長(zhǎng)曲線圖(生長(zhǎng)滴度CCU測(cè)定法)
圖3不同接種濃度滑液支原體pH值變化圖
圖4 1～5代菌生長(zhǎng)滴度的對(duì)數(shù)圖
時(shí)間/hF1(CCU·mL-1)F2(CCU·mL-1)F3(CCU·mL-1)F4(CCU·mL-1)F5(CCU·mL-1)05.05×1055.50×1061.00×1061.00×1061.00×10661.00×1051.00×1061.00×1061.00×1065.50×106185.50×1075.50×1081.00×1085.50×1081.00×109241.00×1081.00×1081.00×1091.00×1085.50×108301.00×1081.00×1085.50×1081.00×1081.00×108345.50×1075.50×1061.00×1085.50×1075.50×106401.00×1075.05×1045.50×1071.00×1061.00×105
表4 1～5代菌生長(zhǎng)滴度差異比較表
同傳代體積差異比較
從表5可以看出兩種傳代體積MS不同生長(zhǎng)情況，在菌液濃度樣本重復(fù)次數(shù)相同(n=4)的情況下，3組傳代方式的MS平均活菌濃度依次為(6.6±2.1)×107、(5.6±0.4)×107、(13.3±2.5)×107CFU/mL。對(duì)3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)3組平均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示：組1和組2無(wú)顯著差異，組3分別和組1、組2之間存在極顯著差異(P<0.01)，就MS活菌濃度而言，組3傳代方式優(yōu)于組1、組2，即用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養(yǎng)基的方式更利于MS生長(zhǎng)。
表5不同傳代體積滑液支原體活菌濃度表
注：用LSD法進(jìn)行多重比較，同列標(biāo)有不同大寫(xiě)字母A、B者表示組間差異極顯著(P<0.01)，即組3與組1、組2組間差異極顯著；標(biāo)有不同小寫(xiě)字母a、b者表示組間差異顯著(P<0.05)，即組3與組1、組2組間差異顯著，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母b者表示組間差異不顯著(P>0.05)，即組1、組2組間差異不顯著
討論與小結(jié)
傳代比例菌種傳代是常用的微生物試驗(yàn)技術(shù)之一，細(xì)菌及支原體常用的傳代比例通常為10%，魏順在MS培養(yǎng)時(shí)，先將菌株復(fù)蘇，再以1∶9比例接種，通過(guò)肉眼判斷，當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌壬蚍狐S色時(shí)收獲[6]，劉軼秋等則是將-20℃凍存的MS恢復(fù)原體積后，再按5%比例接種[4]。本試驗(yàn)比較了5%與10%傳代比例的生長(zhǎng)曲線，從結(jié)果來(lái)看，5%與10%兩種比例接種的MS，活菌濃度與生長(zhǎng)滴度均呈先升高后降低的趨勢(shì)，二者活菌濃度峰值均出現(xiàn)在24 h，而生長(zhǎng)滴度的峰值是18 h，二者生長(zhǎng)滴度不小于108CCU/mL時(shí)間區(qū)段均為18～24 h，生長(zhǎng)滴度峰值均差異不明顯，但傳代濃度5%與10%相比有兩點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，一是傳代比例下峰值活菌濃度高，前者近乎于后者2倍，差異明顯；二是5%傳代比10%傳代pH值下降慢，即比較同時(shí)間點(diǎn)pH值，5%傳代比例比10%傳代比例高，MS是一類對(duì)pH值較敏感的微生物，pH值低于6.8時(shí)極易死亡[7]，基于活菌濃度和pH值綜合考慮，建議在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，MS復(fù)蘇后，將5%作為傳代比例。
3.2收獲時(shí)間《中國(guó)獸藥典》規(guī)定，改良Frey氏培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)最小變色單位不小于108[3]，在日常檢驗(yàn)中，為保證檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、客觀、有效，所使用工作菌液生長(zhǎng)活性不能過(guò)高或過(guò)低，過(guò)高導(dǎo)致培養(yǎng)基檢驗(yàn)敏感性低，過(guò)低則使敏感性高。選擇接種濃度為5%，培養(yǎng)18～24 h，生長(zhǎng)滴度維持在108CFU/mL與109CFU/mL之間，理論上，可以在18～24 h內(nèi)收獲菌液。每次試驗(yàn)的菌種、環(huán)境、操作不盡相同，具體的收獲時(shí)機(jī)需要依賴pH值測(cè)定，周錦龍等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為6.9的時(shí)候，活菌濃度達(dá)到最高[5]，從本次試驗(yàn)來(lái)看，pH值為6.95時(shí)為菌液發(fā)生變色的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。基于以上綜合分析，建議菌液培養(yǎng)18～24 h內(nèi)，菌液即將發(fā)生變色之時(shí)收獲。3.3菌種代次為保證檢驗(yàn)過(guò)程中菌種均一、一致，《中國(guó)獸藥典》規(guī)定改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌MS傳代不可超過(guò)5代[3]，鑒于此，本次試驗(yàn)只針對(duì)1～5代菌進(jìn)行比較。從結(jié)果來(lái)看，1～5代菌生長(zhǎng)滴度不小于108CFU/mL,收獲時(shí)間段基本重疊于18～30 h(1代略顯遲滯)，但峰值會(huì)隨著代次增加而略有抬升，因?yàn)殡S著傳代次數(shù)增加，支原體對(duì)培養(yǎng)基適應(yīng)性更強(qiáng)，生長(zhǎng)更好。通過(guò)分析，1～5代菌均可用作培養(yǎng)基質(zhì)控菌工作菌液，但在實(shí)際工作中，可綜合考慮凍存菌種代次、保存時(shí)間等影響種子菌液活性的客觀因素，再科學(xué)確定工作菌液代次。
傳代體積傳代體積是培養(yǎng)基檢驗(yàn)、生物制品生產(chǎn)等過(guò)程中一項(xiàng)重要技術(shù)參數(shù)，杜德艷等通過(guò)測(cè)定豬肺炎支原體在不同容積培養(yǎng)瓶中CCU值和pH變化值得出，菌種在小容量瓶培養(yǎng)與在萬(wàn)瓶培養(yǎng)相比，生長(zhǎng)更快，CCU值亦更高[8]，由于在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，所需要菌液量較少，故本試驗(yàn)選取了3組菌液與培養(yǎng)基體積搭配。通過(guò)比較分析，“0.5 mL菌液+9.5 mL培養(yǎng)基”的傳代方式優(yōu)于“0.1 mL菌液+1.9 mL培養(yǎng)基”和“0.2 mL菌液+3.8 mL培養(yǎng)基”，具有極顯著差異，而后兩者間無(wú)顯著差異，故在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，建議使用“0.5 mL菌液+9.5 mL培養(yǎng)基”的傳代方式。
本試驗(yàn)首次結(jié)合CFU計(jì)數(shù)法、CCU測(cè)定法以及pH值測(cè)定法，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)和pH值測(cè)定，確定了MS體適宜傳代比例、收獲時(shí)間、菌種代次以及傳代體積，為改良Frey氏液體培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。
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