豆豉纖溶酶產(chǎn)酶菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線
豆豉纖溶酶(douchi fibrinolytic enzyme，DFE)是我國學(xué)者從傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中分離得到的一種絲氨酸蛋白酶。有研究表明，該酶是一種新型纖溶酶，不僅具有半衰期長、纖溶活性高、安全無毒、口服效率高等優(yōu)點，還可彌補目前臨床上治療血栓性疾病使用的溶栓劑如尿激酶和鏈激酶半衰期短、成本高、效率低等不足。因此，通過各種微生物來源的纖溶酶治療血栓新型藥物的研究開發(fā)受到世界各國學(xué)者的重視。
本研究以市售水豆豉為原材料，采用平板法初篩和化學(xué)法復(fù)篩相結(jié)合的方法，旨在篩選出1株活性較高的豆豉纖溶酶產(chǎn)酶菌株，為將水豆豉及相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品研發(fā)成具有溶栓作用的健康產(chǎn)品提供了備選菌株及理論依據(jù)。
樣品來源
在四川、云南和貴州省收集11種水豆豉樣品，收集后的樣品立即進行細菌分離培養(yǎng)，并將剩余樣品存于滅菌均質(zhì)袋中，-80℃冰箱保存。
細菌生長性能測定
將已鑒定的菌株復(fù)蘇后每2 h吸取一定量菌液，用酶標(biāo)儀在600 nm下檢測其OD值，至28 h結(jié)束，繪制菌株的生長曲線；另每2 h吸取一定量菌液離心后取其上清液，過0.22μm濾膜后檢測豆豉纖溶酶含量，至28 h結(jié)束，繪制菌株的產(chǎn)酶曲線。
B61菌株生長曲線及產(chǎn)酶曲線
為了考察B61菌株的生長能力及產(chǎn)酶能力，繪制其生長曲線及產(chǎn)酶曲線，結(jié)果見圖4。可見菌株生長2 h后便進入對數(shù)期，生長14 h后進入穩(wěn)定期，18 h后進入衰亡期。菌株生長6 h后可檢測到豆豉纖溶酶活性，生長到16 h時酶活性達到最高，為826.25 IU/mL，繼而穩(wěn)定至20 h，然后緩慢下降。產(chǎn)酶曲線與生長曲線具有一定的同步性。
B61的生長曲線與產(chǎn)酶曲線
討論
本研究以收集云、貴、川地區(qū)水豆豉為原材料，利用不同培養(yǎng)基對分離菌株進行產(chǎn)酶能力的初步篩選，平板法發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、豆豉纖溶酶的比例分別為98.7%、83.5%、98.7%。再從中選擇產(chǎn)酶能力較強的6株菌進行化學(xué)法復(fù)篩，得到產(chǎn)酶能力最強的菌株B61，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌是Ruiz-Garcia等于2005年新命名的芽孢桿菌種，隨后被Wang等確定為解淀粉芽孢桿菌的后期異型體。所以貝萊斯芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的親緣性較近，但目前未見能將二者分開的生化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，第八版的伯杰細菌手冊中，也未見具體描述貝萊斯芽孢桿菌的生化反應(yīng)。
Fan B等于2007年提出貝萊斯芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌在ANI和dDDH上的區(qū)別是在區(qū)分物種的界值以下的，所以建議都納入解淀粉芽孢桿菌組。因此，在GenBank中，貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌也均屬于Bacillusamyloliquefaciens。Hee C B等對解淀粉芽孢桿菌組的3個菌種基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌富含次生代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因，也有更多參與抑菌化合物合成的基因。
目前關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)豆豉纖溶酶能力的相關(guān)發(fā)現(xiàn)較少，僅查看2019年Yao Z等從傳統(tǒng)海鮮發(fā)酵物中分離到1株產(chǎn)豆豉纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌。在本研究中，該貝萊斯芽孢桿菌的生長曲線2～14 h為對數(shù)生長期。
不同文獻中同一種菌的生長曲線略有差異，吳擁軍等報道枯草芽孢桿菌的對數(shù)生長期為5～10 h，解淀粉芽孢桿菌為2～16 h，與貝萊斯芽孢桿菌接近。張旭等報道解淀粉芽孢桿菌的豆豉纖溶酶活性在2 h即能檢測出，在24 h達到最大值，而本研究中，6 h可檢測到豆豉纖溶酶活性，16 h達到最大活性，造成差異的可能原因是該文獻采用的化學(xué)法，檢出限相對于平板法較低。
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