我國國內(nèi)流行的D型流感病毒株HY11生物學(xué)特性鑒定
流感病毒分為A、B、C、D四個亞型。D型流感病毒(InfluenzaD virus,IDV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種流感病毒類型。研究表明，IDV在牛群中引發(fā)輕度至中度呼吸系統(tǒng)疾病，病毒可以同時在牛的上下呼吸道中進行復(fù)制。流行病學(xué)研究顯示，IDV在北美、歐洲、亞洲、非洲等國家均有流行。牛被認(rèn)為是IDV的自然宿主。血清學(xué)研究表明，養(yǎng)殖廠從業(yè)人員血清中可以檢測到IDV的抗體存在，顯示其可能感染人。但是還沒有分離到活病毒粒子。因此，分離并鑒定出D型流感病毒對流感病毒的研究具有重要意義。
疫苗是防控流感病毒感染和傳播最有效的手段。流感病毒滅活疫苗應(yīng)用最為普遍。IDV是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征的重要關(guān)聯(lián)因子，對養(yǎng)殖業(yè)有潛在嚴(yán)重危害。目前國內(nèi)尚沒有相關(guān)疫苗用于養(yǎng)殖動物預(yù)防該病的研究。因此，開展流行病學(xué)調(diào)查，選擇我國國內(nèi)流行的D型流感病毒株，制備可以保證免疫及保護效果的滅活疫苗是非常必要的。
2D型流感病毒生物學(xué)特性鑒定
(1)透射電鏡觀察
電鏡下所見病毒粒子呈球狀，其表面有纖突，病毒顆粒大小(100-120nm)和形態(tài)符合流感病毒的典型特征。
(2)間接免疫熒光
為了進一步證明從牛身上分離的病毒能夠在細胞培養(yǎng)物中復(fù)制，通過免疫熒光分析來證實。然而，目前還沒有針對IDV的商用抗體，因此定制了一種針對D/bovine/Oklahoma/660/2013株原型的核蛋白(NP)的定制抗體(北京義翹神州科技股份有限公司，貨號MF17MY2622)。之前文獻報道已經(jīng)證明了用于免疫熒光(IF)的NP-抗體的特異性(NP抗體Holwerda M,Kelly J,Laloli L,Stürmer I,Portmann J,Stalder H,DijkmanR.Determining the Replication Kinetics and Cellular Tropism of Influenza DVirus on Primary Well-Differentiated Human Airway EpithelialCells.Viruses.2019Apr24；11(4):377.doi:10.3390/v11040377.PMID:31022887；PMCID:PMC6521319.)。病毒感染48小時后，可檢測到相當(dāng)數(shù)量的病毒抗原陽性細胞。
(3)生長曲線
測定了第五代細胞毒株、雞胚毒株以及噬斑純化后斑塊感染HRT-18G細胞毒株的病毒滴度，結(jié)果為105.25～106.25TCID50/mL左右。
研究了HY11毒株在HRT-18G(購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫，ATCC NO.CRL-11663)、MDCK(購自于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0153)、MDBK(購自于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0154)以及原代牛睪丸細胞(購自于北京博易匯科生物技術(shù)有限公司)的復(fù)制動力學(xué)，通過TCID50滴定了病毒在MDCK細胞中的病毒滴度。以0.1倍感染率(MOI)接種HRT-18G、MDCK、MDBK以及Bovine testicle cell細胞HY11株，在不同時間點(24、48、72和96小時)收集細胞培養(yǎng)上清。結(jié)果表明，分離出的HY11在這幾種細胞中復(fù)制活躍，趨勢相似，72小時后達到最高滴度。圖1所示為間隔24小時的生長曲線。
(4)系統(tǒng)發(fā)育分析
使用MEGAXI對HEF基因片段的核苷酸序列進行了排列和分析，并進行了1000次引導(dǎo)重復(fù)。主要節(jié)點左側(cè)的Bootstrap分?jǐn)?shù)至少為70。IDV五個現(xiàn)存譜系(D/OK-、D/660-、D/Yama2016-、D/CA2019-和D/Yama2019--品系)的每個分支分別用藍色、橙色、紫色、綠色和紅色標(biāo)出。本研究中描述的菌株(D/bovine/Jilin/HY11/2023,D/bovine/Jilin/HY15/2023and D/bovine/Jilin/HY19/2023)用星號標(biāo)記。在中國發(fā)現(xiàn)的菌株加粗標(biāo)出，結(jié)果如圖2所示。
結(jié)論
D型流感病毒的保藏名稱為D/bovine/Jilin/HY11/2023，拉丁名為Influenza D virus，于2024年01月05日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNO：45769。電鏡下觀察到流感病毒樣粒子，間接免疫熒光實驗證明其是D型流感病毒株。通過熒光分子進化樹分析顯示該毒株是中國流行株，目前已獲得其全基因序列，同時測定了其在細胞上的生長曲線，顯示其可以在細胞上生長良好，此外，HY11可以在雞胚中進行高滴度的增殖，為研制D型流感病毒滅活疫苗提供了基礎(chǔ)。HY11培養(yǎng)后經(jīng)滅活、濃縮、純化，免疫豚鼠后可以產(chǎn)生高滴度的抗體，抵抗D型流感病毒野毒株的攻擊，可以有效預(yù)防D型流感病毒。
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