不同碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、PH值對(duì)褐藻酸降解菌AGN12菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
海帶是我國(guó)產(chǎn)量最高的海藻類生物，富含褐藻酸鹽（alginate）類多糖聚合物。褐藻酸降解菌能分泌褐藻酸酶，使褐藻酸多糖轉(zhuǎn)化為具有多種生物活性的寡聚糖，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)并增強(qiáng)抵抗力。為此，從腐爛的海帶汁中篩選和分離得到菌株AGN12，利用其體內(nèi)的酶水解褐藻酸鹽，采用單因素試驗(yàn)研究其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶條件，旨在為利用酶法降解褐藻酸多糖生成有活性的寡糖提供工藝參數(shù)。
1材料與方法
1.1原料與試劑
將新鮮海帶破碎后，置于三角瓶中發(fā)酵數(shù)天，得腐爛海帶汁，通過發(fā)酵、富集、培養(yǎng)、選擇、分離得到AGN12菌。
碳源為褐藻酸，產(chǎn)自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司;氮源為蛋白胨和酵母浸粉，產(chǎn)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;硫酸銨產(chǎn)自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1不同碳源對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整碳源，即分別添加濃度均為0.6%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、海藻酸、微晶纖維素、果糖、甘露糖和山梨糖，配制含有不同含碳化合物的培養(yǎng)基。然后按3%的接種量接入菌液，于30℃液體培養(yǎng)16 h后，測(cè)定發(fā)酵液的生物量和上清液的酶活力。
1.2.2不同氮源對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響在含0.6%褐藻酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整氮源，分別添加濃度均為0.2%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、酪蛋白水解物、硝酸銨和硫酸銨，配制含有不同含氮化合物的培養(yǎng)基。按3%的接種量接入菌液，于30℃液體培養(yǎng)16 h后，測(cè)定發(fā)酵液的生物量和上清液酶活力。
1.2.3培養(yǎng)溫度對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響按3%的接種量接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別在20，25，30，35℃下液體培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液的生物量和上清液酶活力。
1.2.4培養(yǎng)基初始pH值對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響將生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)至3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0。然后按3%的接種量接入菌液，30℃液體培養(yǎng)16 h，測(cè)定發(fā)酵液的生物量并測(cè)定上清液的酶活力。
1.2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響在上述最佳產(chǎn)酶條件下，按3%的接種量培養(yǎng)菌體，前24 h內(nèi)每隔2 h取樣，24 h后每隔12 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的生物量和酶活，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。
2結(jié)果與討論
2.1不同碳源對(duì)生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
不同碳源對(duì)AGN12菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見表1。
由表1可知：AGN12菌對(duì)不同碳源的利用有很大差別，以海藻酸作為碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，酶活力最高，即產(chǎn)酶量最高;用酵母浸粉、甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖做碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量也較低，說明AGN12菌對(duì)這幾種碳源的利用效果不好;以山梨糖、CMC、可溶性淀粉、蔗糖為碳源時(shí)，菌體不生長(zhǎng)，也檢測(cè)不到酶活。由此可以得出結(jié)論，海藻酸鈉是最佳碳源。
2.2不同氮源對(duì)生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響
不同氮源對(duì)AGN12菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響見表2。
由表2可見：在含有機(jī)氮源牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物的培養(yǎng)基中，AGN12菌能迅速生長(zhǎng)并具有較高的產(chǎn)酶能力;在含蛋白胨、酵母浸粉的培養(yǎng)基中，AGN12菌也能迅速生長(zhǎng)并具有一定的產(chǎn)酶能力;在含有無機(jī)氮源硫酸銨、硝酸銨的培養(yǎng)基中，AGN12菌的生長(zhǎng)情況不及含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基，但以硫銨為氮源時(shí)，AGN12菌具有很高的產(chǎn)酶能力。從空白來看，AGN12菌在不含任何氮源的培養(yǎng)基中能迅速生長(zhǎng)并有較高的產(chǎn)酶能力。將空白與含有機(jī)氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)酶情況相比較，發(fā)現(xiàn)部分有機(jī)氮源抑制菌產(chǎn)酶。
2.3培養(yǎng)溫度對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
受試驗(yàn)條件限制，僅選擇20，25，30，35℃共4個(gè)溫度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。
由圖1可知，從20℃開始，隨著溫度的升高，細(xì)菌生長(zhǎng)情況良好，酶活不斷增強(qiáng)。測(cè)裂解酶酶活即粘度發(fā)現(xiàn)，20℃和25℃的產(chǎn)酶情況相差不大，而另一酶活指標(biāo)還原糖生成量隨溫度升高不斷升高;30℃是生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最佳溫度，菌體生長(zhǎng)迅速，生物量和產(chǎn)酶量達(dá)到最高。但溫度升高到35℃時(shí)，菌開始停止生長(zhǎng)。
2.4培養(yǎng)基初始pH值對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整為3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0，初始pH值對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響見圖2。
由圖2可以看出：在pH 8.0的培養(yǎng)基中，菌體長(zhǎng)最好，產(chǎn)酶量最高，其次為pH 7.0的培養(yǎng)基。由此確定培養(yǎng)基最適初始pH值為8.0。
2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響見圖3。
在前6 h里，菌體處于延滯期;6～22 h，菌體生長(zhǎng)迅速，表明菌體處在對(duì)數(shù)期，并在24 h時(shí)菌體濃度達(dá)最大值，OD600為1.004（稀釋二倍）;此后，菌體生長(zhǎng)變慢，處于穩(wěn)定期;在26 h后菌體開始自溶，濃度不斷下降。
從還原糖濃度變化來看：發(fā)酵液中的酶活力逐漸升高，在24 h達(dá)到最高;此后菌體量開始下降，酶活力在24～72 h之間呈穩(wěn)定狀態(tài)，72 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。故24 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。
3結(jié)論
以菌株AGN12為試驗(yàn)對(duì)象，以碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度等為因素，研究褐藻酸降解菌的最佳生長(zhǎng)及產(chǎn)酶條件。通過單因素試驗(yàn)確定AGN12菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的最佳條件為：以0.7%海藻酸鈉為碳源，以0.3%硫酸銨為氮源，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值8.0，培養(yǎng)時(shí)間24 h。
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