10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（三）
3、討論
A.ferrooxidans BYM在好氧條件下能夠以培養基中的FeSO4為底物進行磁小體合成。隨著研究的不斷深入，發現這類細菌在一定程度上能夠吸收特定有機物轉化為細胞的生長物質，但是其同化能力有限[14]。研究發現，A.ferrooxidans BYM生長和磁小體合成受到培養基組分和培養條件的影響[28]。由于不同有機物可以調節亞鐵轉運，改變細胞膜通透性，從而達到促進A.ferrooxidans BYM生長的目的。因此，本研究以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，分別添加10種不同濃度有機物，根據亞鐵氧化速率判斷不同濃度有機物對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化的效果，為進一步探究A.ferrooxidans BYM磁小體的發酵奠定基礎。
研究表明，不同濃度的檸檬酸可能影響A.ferrooxidans磁小體相關基因mpsA、feoB、tonB及mpsA的表達，推測其原因可能是由于檸檬酸能夠螯合Fe3+，促進A.ferrooxidans對Fe3+的轉運[29]。對A.ferrooxidans R2進行低分子量有機酸耐受試驗，結果表明A.ferrooxidans R2可以耐受40 mmol/L的檸檬酸[30]。因此，本研究選擇檸檬酸探究其對A.ferrooxidans BYM菌體生長的影響。酒石酸作為常見的金屬螯合劑常用于重金屬吸附，能夠較好地吸附被污染土壤中的鎳、銅、鋅、鎘和鉛[31]。0.5 mmol/L抗壞血酸能夠完全抑制A.ferrooxidans NCIM 5370中的過氧化氫酶活性[32]。其還原作用能夠減少Fe3+的積累，加速鐵的循環。因此推測，試驗中添加l-抗壞血酸能夠通過還原作用消耗A.ferrooxidans BYM代謝產生的Fe3+，同時減少活性氧和自由基對A.ferrooxidans BYM的損傷。蘋果酸作為一種小分子量有機酸常用于金屬生物浸出[33]。因此，本研究添加蘋果酸，判斷其對A.ferrooxidansBYM菌體生長的影響。在培養基中添加l-甘氨酸能夠促進A.ferrooxidans CK浸出膠磷礦的效率，通過試驗結果可知，l-甘氨酸的存在能夠顯著增強細菌在礦物表面的吸附作用[34]。葡萄糖酸作為鐵螯合劑能夠在一定程度上促進A.ferrooxidans ATCC 23270生長[35]。因此，本研究通過添加葡萄糖酸驗證其對亞鐵氧化的作用。10 mmol/L的吐溫-80能夠促進A.ferrooxidans ATCC 23270生長以及S0和CuFeS2的代謝，其能夠改變A.ferrooxidans細胞表面多聚物[36]。Jafari等報道，10 mmol/L SDS會影響A.ferrooxidansATCC 23270生長，引起細胞膜損傷和礦物表面親水性變化，抑制A.ferrooxidans亞鐵氧化，降低銅浸出率[37]。由于SDS對A.ferrooxidans的強抑制作用，即使將SDS濃度降低至0.001 mmol/L，其仍能夠抑制A.ferrooxidans BYM生長。在搖瓶試驗中，通過添加30 mmol/L TritonX-100在A.ferrooxidans XZ11浸取黃銅礦的體系中，培養24 d，結果表明銅的生物浸出率相較于未添加有機物組提升了42.21%[38]。0.04 mmol/L EDTA處理A.ferrooxidans 1 h后，能夠去除表面脂多糖，對細胞形態和活性均未產生影響[39]。
結果表明(圖4)，有機酸中l-抗壞血酸和蘋果酸對A.ferrooxidans BYM生長具有促進作用。抗壞血酸作為微量元素可以參與生物體的代謝過程，作為小分子抗氧化劑可以中和細胞代謝產生的活性氧和自由基對機體造成的損傷[40]。抗壞血酸作為輔酶因子為羥化酶和單加氧酶等15種哺乳動物內酶提供電子，參與了肉堿、膠原蛋白和神經遞質合成等過程[41]。因此，可推測試驗中添加l-抗壞血酸能夠通過還原作用消耗A.ferrooxidansBYM代謝產生的Fe3+。檸檬酸的添加不能促進A.ferrooxidans BYM生長。蘋果酸作為三羧酸循環中的一環，其在某種程度上促進了菌體的代謝，從而對亞鐵氧化產生了促進作用。本研究通過添加0?30 mmol/L蘋果酸，明確了5 mmol/L的蘋果酸能夠促進A.ferrooxidans BYM生長。葡萄糖酸能夠螯合培養基中的鐵離子，從而促進A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化速率。吐溫-80、TritonX-100以及SDS對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化均起到了抑制作用，這可能是由于以上3種表面活性劑改變了A.ferrooxidans BYM細胞表面張力，抑制了A.ferrooxidans BYM生長，從而導致亞鐵氧化速率降低。本研究選擇EDTA-2Na的原因是其相較于EDTA在酸性條件下更容易溶解，因此選擇EDTA-2Na作為外源有機物進行試驗。結果分析表明，EDTA-2Na不能促進A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化，并且隨著EDTA-2Na濃度升高，可能會螯合培養基中的鐵離子，抑制A.ferrooxidansBYM生長。
向M.magneticum AMB-1培養體系中添加EDTA、羅丹明B、抗壞血酸、赤蘚紅、鄰氨基苯甲酸、檸檬酸、3-(N-嗎啉)丙磺酸、3-(環己胺)-1-丙磺酸、鈣黃素、葡聚糖、阿侖膦酸、奈立膦酸和煙酰胺等鐵螯合劑可以促進菌株生長并提高磁小體產量；我們前期的研究也發現，葡萄糖酸可以有效促進A.ferrooxidans的生長并促進菌體合成磁小體[42]。一些有機物可以使細菌的表面變得更為光滑，并使菌體表面的官能團變化[43]。這與本研究SEM及FTIR獲得的經葡萄糖酸處理后A.ferrooxidans BYM表面變得光滑(圖6A、6B)、表面官能團發生變化的結果一致(圖7)。對于趨磁的磁小體合成細菌M.magneticum AMB-1而言，有機物可以通過增加磁小體鏈的長度來提高其單個細胞的磁小體數量[42]，盡管非趨磁性的A.ferrooxidans BYM不存在磁小體鏈，但葡萄糖酸作用后菌體內的磁小體數量仍然增加，原因可能是葡萄糖酸促進了菌體對鐵的吸收，具體機制仍需要進一步研究。
微生物發酵動力學能夠探究A.ferrooxidans BYM在整個發酵過程中的菌體變化、磁小體生成和亞鐵消耗情況，此過程為磁小體的規模化發酵提供理論和實踐依據。發酵動力學作為描述發酵過程微生物生長、產物生成和底物消耗的學科，能夠在發酵過程中通過模型建立實現發酵的動態監控，以達到高效生產。目前，發酵動力學主要分為菌體生長動力學、產物生成動力學和底物消耗動力學。Logistic方程作為經典菌體生長動力學模型，廣泛用于微生物的發酵研究，Logistic方程描述了三孢布拉霉發酵生產番茄紅素過程中菌體生長情況，并很好地描述了菌體生長的動態情況[44]。Logistic方程對于嗜酸乳桿菌的菌體發酵進行描述，并對其在48 h內菌體生長進行分析[21]。對拉曼HLY0902進行搖瓶發酵動力學研究，利用Logistic方程建立了菌體生長動力學模型[20]。產物生成動力學是描述產物生成與菌體生長之間的關系的科學，通過對產物生成動力學的探究，可以明確單一發酵和復合發酵的不同機制。底物消耗動力學一般與細胞生長、產物生成和維持底物消耗的能量3種因素相關。通過描述發酵動力學，能夠對菌體生長、目標產物生成、底物消耗過程等階段進行明確調控，這對于分批發酵和連續發酵生產具有關鍵性意義。
本文以A.ferrooxidans BYM為目的菌株，探究在10 mmol/L葡萄糖酸下4 L發酵體系代謝變化。通過分批培養測定A.ferrooxidans BYM的生物量、磁小體生成量和亞鐵氧化速率，明確A.ferrooxidans BYM在各個階段的變化情況。基于經典Logistic方程、Luedeking-Priet方程以及發酵動力學模型成功構建了A.ferrooxidans BYM菌體生長、磁小體合成及亞鐵消耗動力學模型，其擬合度R2分別為0.99、0.98及0.98，數值均大于0.90，說明模型能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM發酵動力學。通過非線性擬合的方法擬合得到的3個方程與實際值接近，誤差較小，能夠很好地反映A.ferrooxidans BYM在各個階段發酵變化。3個發酵模型的建立為今后的發酵條件控制和磁小體規模化發酵提供了一定的理論參考價值。
4、結論
本研究以A.ferrooxidans BYM為研究對象，通過單因素試驗探究10種外源添加有機物對其生長的影響，根據試驗結果篩選得到對磁小體合成促進效果最明顯的一種有機物。在最優促進劑下對A.ferrooxidans BYM在發酵過程中的菌體生長、磁小體合成以及亞鐵消耗動力學進行研究。通過以上探究過程，本研究得出以下結論：
(1)通過亞鐵氧化速率的測定，篩選出l-抗壞血酸、蘋果酸以及葡萄糖酸對A.ferrooxidans BYM生長具有顯著的促進作用，并確定了合適的濃度范圍。
(2)通過4 L體系發酵試驗，對3種有機物進行濃度優化。獲得最優促進劑葡萄糖酸，以10 mmol/L添加時，磁小體產量可達2.00×10?3 g/L。
(3)通過不同時間梯度的分批發酵試驗，本研究建立了A.ferrooxidans BYM的菌體生長、磁小體生成和亞鐵消耗動力學模型。
研究結果表明在葡萄糖酸的作用下能夠對A.ferrooxidans BYM發酵過程進行調控，改善磁小體發酵過程，為后續大體系通過微生物發酵產磁小體提供理論及實踐依據。
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（一）
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（二）
10種有機物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發酵、產量的影響（三）