貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis B6生長曲線、驅油功能特性評價（一）
摘要
【目的】篩選油藏內源功能微生物并探究其驅油機理，現場試驗以確定油藏內源微生物提高原油采收技術應用的工藝和技術可行性。【方法】采集英東油田樣品，利用原油平板篩選驅油功能菌，評價其環境適應性并優化培養條件，通過乳化性能、降黏防蠟和烴轉化能力等評估其驅油性能并探索其潛在機制，并在油田現場進行微生物強化驅油試驗。【結果】從油水樣品中分離到的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)B6，其乳化活性指數(emulsifying activity index,EI24)值為100.00%，降黏率為97.20%，防蠟率為86.90%，表明菌株B6具有良好的乳化降黏性能，具有提高原油采收的潛力，并且能夠減少原油中的重質組分而增加輕質烴類，改善原油物性，提升原油品質。進一步在英東油田、躍進油田和花土溝油田進行微生物單井吞吐和清防蠟作業，共進行62井次現場試驗，累計增油1 460.36 t，平均延長洗井周期47 d，經濟效益為342.50萬元，投入產出比為1:4。【結論】通過室內研究和現場試驗，證實內源微生物Bacillus velezensis B6具有顯著提高原油采收和油井清防蠟的效果，應用潛力巨大。
1、前言
石油作為當今社會的重要能源之一，在世界經濟和人類社會的發展中起著至關重要的作用。自工業革命以來，隨著石油化工行業的深入發展，全球石油需求量不斷增加，且原油價格持續上漲。但是，隨著油田開采年限的增加，常規易采石油資源儲量越來越少，原油采收率越來越低。目前地下油藏環境中仍有大量原油亟待有效開采，其殘留的剩余原油占60%–70%。因此，如何綠色、高效、經濟地開采出地下剩余原油不僅是能源領域的研究熱點，而且事關國家經濟發展和社會穩定。
微生物強化采油(microbial enhanced oil recovery,MEOR)是隨著3次采油而發展的新興技術，具有工藝簡單、成本低廉和環境友好等特點，在國內外被廣泛推廣使用，是最具有發展前景的采油技術之一。微生物強化采油技術工藝主要包括微生物單井吞吐、微生物清防蠟、微生物驅替和微生物選擇性封堵，同時也開發了基于微生物強化采油的多種工藝的整合，如多輪吞吐、清防蠟耦合單井吞吐等驅油技術。近20余年來，篩選了大量高產生物表面活性劑或石油烴降解等的微生物，絕大多數菌株已在室內研究中證實了其具有驅油的性能，為提高剩余原油的采收奠定了堅實的基礎，但目前現場試驗驗證和應用仍嚴重不足。目前，勝利油田和大慶油田等是我國微生物強化驅油技術現場應用較為成熟且取得成果的油田。然而，油藏地層環境具有明顯的地質特異性、非均質性強，油藏模式復雜多樣，這導致微生物強化采油技術的具體應用表現出一定的特異性，因而需要依據油藏環境和原油物性施用合適的驅油微生物。
針對青海油田地層油藏環境礦化度較高和原油采出率較低等現實問題，本文通過對篩選獲得的內源微生物貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)B6生長及其功能特征的研究，從而評估該菌株對原油的作用效果。該菌株經規模化培養后在英東油田、躍進油田和花土溝油田開展微生物單井吞吐和清防蠟試驗，實現原位乳化降黏和井筒清防蠟，提高原油流動性并增加油井洗井周期，驗證其實際應用價值。本項研究為開發適用于較高礦化度油藏中稠油冷采的綠色生物采油體系提供了科學依據和技術支撐。
2、結果與討論
2.1菌株B6的鑒定及其生長性能
基于在線工具NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和EZBioCloud(www.ezbiocloud.net/identify)對篩選獲得的驅油功能菌株B6的16S rRNA基因全長序列進行比對分析，結果表明菌株B6屬于Bacillus屬，Bacillus velezensis種。使用MEGA 11.0構建進化樹后使用iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行美化調整。菌株B6與B.velezensis CR-502、B.velezensis JK19和B.velezensis JS25R等親緣關系更近(圖1)，命名為B.velezensis B6，NCBI序列號為OR277460。國內外關于B.velezensis的研究主要集中在拮抗動植物病原菌，促進動植物生長等方面。最近的一篇報道表明B.velezensis由于其高產生物表面活性劑而在微生物強化驅油中取得了良好的應用效果，但是其環境適應性和驅油功能特性與菌株B6存在不同。此外，與菌株B6親緣關系更近的B.velezensisSRCM102755等菌株基因組中均含有生物表面活性劑合成基因srfAA、srfAB和srfAC。因此，該菌在微生物強化采油中可能具有重要作用。
圖1菌株B6的系統發育分析
根據生長曲線(圖2)，B.velezensis B6在培養過程中表現出較短的生長周期，培養5 h即可達到對數期，12 h后逐漸到達生長穩定期。在pH 6.0–8.0時菌株B6表現出良好的生長趨勢，而在pH 9.0時，B6則幾乎不生長(圖2A)，且與B.velezensis BSA1相比在pH 8.0時能更快地到達生長穩定期；菌株B6的生長能力隨著培養溫度的升高表現出先增強后降低的趨勢，30℃延緩了其對數期(圖2B)；在100 g/L以上的礦化環境中，菌株B6的生長受到了一定的限制(圖2C)；菌株B6在發酵培養基中比在改良LB培養基中表現出較高的生長優勢(圖2D)。綜上所述，B.velezensis B6在pH 6.0–8.0、30–40℃的環境中能夠良好生長，在100 g/L的礦化度以上生長受到一定抑制，說明本研究分離得到的菌株B6能夠較好地適應油田油藏環境，具有實際應用的潛在價值。
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