棉子糖抑制變異鏈球菌生物膜形成機制研究進展（一）
變異鏈球菌(Streptococcus mutans)是一種具有代表性的生物被膜細菌，它通過葡糖基轉移酶(glucosyltransferase,GTF)活性引起齲齒。葡聚糖是由GTFs從蔗糖中合成的，為S.mutans提供了緊密附著在牙釉質上的結合部位。因此，如果開發出一種干擾GTF功能的新化合物，就有可能控制S.mutans的生物被膜形成。我們發現，天然產物中的一種低聚糖棉子糖能強烈抑制生物膜的形成、GTF相關基因的表達和葡聚糖的產生。此外，通過減少細菌黏附對唾液包裹的羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)生物膜的抑制作用表明棉子糖在口腔健康中的適用性。棉子糖的這些作用似乎是由于其調節S.mutans GTF活性的能力所致。因此，棉子糖可以被認為是一種抗生物被膜劑，用作口腔用品和預防齲齒的牙科材料的物質。
主要內容
1.棉子糖對S.mutans生物被膜形成的影響
棉子糖減少了大多數從人類口腔分離的鏈球菌(KCOM 1136至KCOM 1228)的生物被膜形成(圖1)。與未經處理的生物膜(即對照生物膜)相比，當添加100μM或1000μM棉子糖時，S.mutans和遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus)的生物膜形成平均分別被抑制12-25%和11-17%。
圖1棉子糖處理24小時后的鏈球菌生物膜形成
在靜態條件下，棉子糖處理(0~1000μM)后形成的S.mutans和S.sobrinus的生物膜
誤差條表示五個測量值的標準偏差。**，P<0.005；*，P<0.05，與對照組比較。Raf，棉子糖，下同
特別是，本研究中具有代表性的生物被膜菌S.mutans KCOM1136在棉子糖處理后生物被膜的形成顯著減少，經1000μM棉子糖處理后生物被膜的形成比對照生物膜減少了50%以上。在靜態和流動條件下分析了棉子糖處理對KCOM 1136生物膜形成的抑制作用。在靜態條件下，當棉子糖濃度較高(1000μM)時，生物膜的形成顯著減少44%(圖2A)。在流動條件下，盡管對照生物膜和棉子糖處理生物膜的形態相似，但棉子糖處理生物膜的平均體積和厚度比對照生物膜減小了54%-64%(圖2B)。
圖2靜態和流動條件下棉子糖處理后S.mutans生物膜的形成
(A)棉子糖處理(0-1000μM)后的CV染色生物膜；在靜態條件下(OD545/OD595)測量OD進行定量。(B)基于激光共聚焦顯微鏡圖像的DAPI染色生物膜的體積和厚度；在流動條件下，向S.mutans生物膜中加入1000μM棉子糖處理48h。
棉子糖是一種由半乳糖和蔗糖組成的三糖。然而，在蔗糖和半乳糖分別處理S.mutans生物膜，可以觀察到這呈現相互矛盾的現象。半乳糖顯示出類似于棉子糖的生物被膜抑制活性；相反，蔗糖促進了生物被膜的形成。此外，蔗糖在1000μM時促進S.mutans的生長，而棉子糖處理(0-1000μM)對S.mutans的生長沒有影響。
2.棉子糖抑制S.mutans生物被膜的機制
棉子糖處理后，對S.mutans的蔗糖消耗進行了24 h的監測，以探討棉子糖與蔗糖的關系。用來評估蔗糖消耗的方法適合于檢測蔗糖濃度，但不能響應高濃度的棉子糖，如蔗糖和棉子糖的標準曲線所示(見圖S3)。S.mutans在24小時內消耗了88%的蔗糖(圖3A)。然而，隨著棉子糖和蔗糖濃度的增加，S.mutans的蔗糖消耗量比對照(即不加棉子糖的處理)減少。當10μM、100μM和1000μM棉子糖與100μM蔗糖一起使用時，24 h內分別消耗79%、70%和56%的蔗糖。
圖S3蔗糖和棉子糖的標準曲線(0-1000μM)，用于評估蔗糖消耗試驗的適用性
此外，將不同濃度的棉子糖和蔗糖(0-1000μM)同時加入到S.mutans的培養基中，分析了競爭生物膜的形成。與對照相比，1000μM棉子糖處理后生物被膜形成減少了50%，而同時處理1000μM蔗糖后生物被膜形成減少了26%(圖3B,左)。這一發現表明，棉子糖處理后對生物膜形成的抑制隨著蔗糖濃度的增加而降低。同樣，隨著棉子糖濃度的增加，蔗糖處理后的生物膜形成減少(圖3B,右)。這些結果表明，棉子糖和蔗糖在S.mutans的蔗糖消耗和生物被膜形成方面存在競爭關系。
通過分子對接研究了棉子糖在S.mutans中作為葡聚糖酶抑制劑的可能性。圖3C顯示了棉子糖在S.mutans葡聚糖酶活性部位的最佳對接姿勢。棉子糖的對接位置與葡萄糖酶的活性部位相匹配，并與Asp593形成氫鍵，Asp593被認為是受體糖定位的關鍵氨基酸殘基，影響S.mutans葡糖酶的轉糖基化專一性。然而，蔗糖的對接姿勢僅位于亞基1，它由Arg475、Asp477、Glu515和Asp909組成，沒有與Asp593相互作用，如補充材料中的圖S4A所示。棉子糖和蔗糖中常見的葡萄糖和果糖部分與亞基1位的氨基酸殘基密切接觸。對于D-半乳糖，最好的對接姿勢也只與亞基1的氨基酸殘基密切接觸，包括Asp475、Asp477、Asp909和Gln 960(見圖S4B)。特別是，棉子糖半乳糖部分C-3和C-4位的羥基與Asp593以及亞基1位的氨基酸殘基相互作用，這可能增強其與葡聚糖酶的結合親和力?？傮w而言，對接研究表明棉子糖、蔗糖和半乳糖可能與葡聚糖酶的亞基1位點接觸，總分分別為9.90、7.88和6.42。
圖3棉子糖處理后抑制S.mutans生物被膜形成的可能機制
(A)棉子糖處理的S.mutans生物膜細胞中的蔗糖消耗。在靜態條件下，蔗糖(100μM)和棉子糖(0-1000μM)處理24小時后形成S.mutans生物膜。Suc，蔗糖。(B)棉子糖和蔗糖之間的競爭性生物被膜形成試驗。S.mutans生物膜是在0-1000μM濃度的棉子糖和蔗糖處理后形成的。(C)S.mutans葡糖酶中棉子糖的最佳對接姿勢)。
圖S4(A)蔗糖和(B)D-半乳糖在S.mutans葡聚糖酶活性部位的最佳對接姿勢。
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