顯微鏡直接計數法應用于原料乳細菌總數計算
通過對原料乳細菌數量采用顯微鏡直接細菌計數方法和國標GB478.2-2010菌落總數測定方法進行比較實驗，確定了顯微鏡直接細菌計數方法和國標GB478.2-2010方法間良好相關性。結果表明，顯微鏡直接計數方法檢測時間短，且檢測成本低廉，可以作為原料乳驗收的輔助方法使用。
原料乳細菌總數是衡量生牛乳原料的重要指標。然而鮮乳的菌落總數指標按照GB478.2-2010方法進行檢測需時48h，無法滿足原料乳快速驗收的要求。如果細菌超標的原料乳被用于加工生產，則為加工過程乃至終產品品質帶來影響。
現今用于鮮乳快速計數的檢測方法有顯微鏡檢法、流式細胞計數法45、還原實驗法光電法、電導分析法與阻抗分析法、ATP熒光計數法、PCR技術。各種方法各有其優缺點，有的方法快速但成本昂貴，有的方法操作繁瑣復雜。
顯微鏡直接計數法是基于光學顯微鏡觀察方法，對視野中單個細菌、菌團、酵母、霉菌等微生物的直接計數方法。本文摸索生乳細菌直接鏡檢計數方法并與標準培養方法進行比對，現就該方法的具體情況做一闡述。
1實驗
1.1材料與試劑
2016年5月和6月三次在娃哈哈公司奶源基地采集牛乳，每次采集牛乳10個左右，25室溫保存直至檢測，3次共計28個樣品；0.1%呂氏堿性美藍染色液；平板計數瓊脂。
1.2儀器與設備
超凈工作臺，高壓滅菌鍋，生化培養箱，漩渦震蕩儀，顯微鏡。
1.3方法
采用菌落總數計數和顯微鏡直接計數方法對同一樣品，同時進行取樣的模式進行檢測。
1.3.1菌落總數
參見GB4789.2-2010。
1.3.2顯微鏡直接計數方法
（1）涂片。在載玻片上用標尺畫1 cm×1 cm方框，用微量移液器吸取10μL振蕩后的牛乳，滴加至方框中央，并用無菌接種環將奶液涂勻使其平鋪于方框內。
（2）風干。將涂布好的標本置于通風處吹干至完全干燥。
（3）固定。將玻璃染色支架放在沸水浴上，然后將干燥的涂片置于染色支架上。用蒸汽固定10 min以上。并風干。
（4）染色。取0.1%呂氏堿性美藍染色液對標本進行浸染，染色時間為2 min。取出載玻片，用吸水紙吸取多余的染料，晾干。
（5）觀察。油鏡下觀察細菌數，共計數20個視野細菌數量，最終求細菌數量平均值。
2結果與分析
2.1顯微直接計數方法檢測原料乳細菌總數的重復性
用顯微直接計數方法計對細菌總數不同的28個奶樣同時用兩種方法進行多次檢測，分析用顯微直接計數方法檢測原料乳細菌總數的可靠性，結果如表1所示。
表1顯微直接計數方法檢測原料乳細菌總數的重復性
通過對細菌總數不同的奶樣進行顯微計數檢測結果（表1）可知，所有數據變異系數都小于2%，說明使用顯微計數方法重復性良好，計數平均值具有好的代表性。
2.2兩種方法檢測牛乳細菌總數的比較
同時用顯微直接計數方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數計數兩種方法對細菌含量不同的28個鮮乳樣品進行檢測，結果（圖1）表明，顯微直接計數方法與GB4789.2-2010對鮮乳菌落總數兩種方法間存在良好的線性關系，y=5625.2x+921.31，R2=0.9224。
2.3顯微直接計數方法結果
以美蘭為染色劑的顯微直接計數方法所觀察到的樣品呈現藍色背景，其中脂肪球在顯微鏡下形成明亮的小滴，有強烈的折射光，由于光學現象所致，每個脂肪球表面如有層膜包覆。所有微生物包括細菌和酵母等形態微生物被染上較深的藍色，其在視野中以較清晰的形態存在，如圖2所示。
圖1兩種檢測方法的線性關系
圖2顯微直接計數方法圖片
3結論
本研究所采用直接計數方法是以顯微鏡觀察為基礎，通過制片、染色和觀察等幾個簡單的步驟直接對樣品中細菌數量進行計數方法：
（1）從實驗結果可知，運用顯微鏡直接計數方法檢測原料乳細菌總數與國標方法具有良好的線性（R2=0.9224）。（2）顯微計數時視野的選擇需要選擇微生物分布均勻的視野，需要一個個計數，不管兩個相連或成堆成鏈，均需一個個計數，菌團按一個計數；并在本研究中發現當視野內細菌數量過多時，計數的準確性明顯降低。（3）該方法的優點為能夠在20 min內完成原料乳中的細菌總數的檢測，與GB4789.2-2010方法相比，可以改善由于傳統國標方法培養48h出結果所造成的細菌總數過多而已經投入使用的狀況。（4）與FOSS等細胞計數儀相比，該方法驗收且成本低廉，是一種值得推廣的新型技術。
根據上述實驗方案對A1B3C2與A1B3C3進行2次實驗，A1B3C2得最終平均離心率為0.487%，A1B3C3得最終平均離心率為0.484%，兩組實驗結果非常接近，且觀察21 d后，兩組產品沉淀非常少，析水約0.3 cm，從經濟效益的角度考慮，選擇A1B3C2較為適宜。
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