臨床結核分枝桿菌體外藥敏試驗：分子DST檢測VS表型DST藥敏診斷技術（二）
2結果
2.1分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結果分析
2.1.1兩種檢測方法耐藥性檢測結果一致率1750例標本按流程操作共檢測到結核分枝桿菌菌株1596例，陽性率為91.20%，非結核分枝桿菌（NTM）154例（8.80%）。其中快速分子DST檢測出利福平（RFP）耐藥菌株98例，耐藥率為6.14%（98/1596），表型DST藥敏檢測出利福平（RFP）耐藥菌株88例，耐藥率為5.51%（88/1596）;兩種方法均檢出利福平（RFP）敏感1478例，均耐藥64例，共1542例利福平（RFP）檢測結果一致，一致率為96.62%。快速分子DST檢測出異煙肼（INH）耐藥95例，耐藥率為5.95%（95/1596），表型DST藥敏檢測出異煙肼（INH）91例，耐藥率為5.70%（91/1596），兩種方法異煙肼（INH）均敏感1465例，均耐藥55例，共1520例異煙肼（INH）分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結果一致，一致率為95.24%。見表1。兩種方法共檢測出耐多藥肺結核（MDR-TB）患者34例，耐多藥率為2.13%（34/1596）。
2.1.2分子檢測與表型藥敏對利福平檢測結果分析54例患者利福平（RFP）分子DST檢測與表型DST藥敏結果不同，分子DST檢測利福平（RFP）耐藥而表型DST敏感32例;分子DST檢測利福平（RFP）敏感而表型DST耐藥22例，不一致率為3.38%;利福平分子檢測結果敏感度為97.88%，特異度為74.42%。見表2。
2.1.3分子檢測與表型藥敏對異煙肼檢測結果分析76例患者異煙肼（INH）分子DST檢測與表型DST藥敏結果不同，分子DST檢測異煙肼（INH）耐藥而表型DST敏感40例，分子DST檢測敏感而表型DST耐藥36例，不一致率為4.76%。分子檢測對異煙肼檢測結果敏感度為97.34%，特異度為60.44%。見表3。
2.2分子檢測基因突變位點與表型藥敏檢測結果分析
利福平（RFP）耐藥檢測中，快速分子DST檢測ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），表型DST藥敏利福平耐藥檢出率為93.02%（80/86），其中位點531（C-T）、513（C-A）、516（A-T）、516（G-T）突變位點的檢出一致率高（96.56%～100.00%）;而526（A-G）、511（T-C）位點分子檢測出陽性，表型DST藥敏檢測未顯示;533（T-C）、531（C-G）、526（A-T）位點的一致符合率為50.00%、77.78%、66.67%;利福平（RFP）突變位點分子與表型DST藥敏一致率為87.91%（80/91）。
異煙肼（INH）檢測中，快速分子DST檢測katG、inhA基因突變位點的檢出率為95.79%（91/95）;表型藥敏DST異煙肼耐藥檢出率為87.91%（80/91）;其中katG315（G-C）、inhA15（C-T）位點的一致率較高，分別為88.73%、88.24%，但仍然發現尚有10例不一致;katG 315（G-A）有1例分子與表型DST藥敏結果不一致。見表4。初始分子檢測與表型藥敏結果不一致分析思路見圖2。
3討論
2020年全球結核病報告顯示，2019年，全球有近50萬人罹患利福平耐藥（RR-TB）結核病，其中78%患有耐多藥（MDR-TB）。隨著分子診斷技術的臨床應用，2019年發現并登記MDR/RR-TB患者較2018年增加了10%，但其治療成功率僅為57%。因此，提高細菌學確診的結核病患者比例，擴大細菌學確診的結核病患者耐藥檢測比例，提高治愈率，是遏制耐藥結核病傳播的重要措施。
Xpert MTB/RIF檢測系統是以實時熒光定量PCR技術為基礎，ropB基因為靶基因，檢測周期僅2 h，是目前WHO推薦的RFP耐藥的檢測方法。本研究結果顯示，快速分子檢測ropB基因突變檢出率為94.79%（91/96），與李妍等研究痰標本中Xpert MTB/RIF敏感度高達97.5%、特異度為95%～99%相一致。
基因芯片技術是將MTB的DNA擴增產物與固定在芯片上的探針雜交、掃描芯片及判讀結果，現已廣泛應用于臨床耐藥性的檢測及基因組的比較分析。楊映暉等研究顯示，基因芯片檢測MDR-TB的敏感度與特異度分別為64.62%和97.75%。本研究結果顯示，異煙肼（INH）快速分子檢測中，katG、inhA基因突變位點的檢出率為95.79%（91/95），與相關文獻研究結果一致。
本研究通過對2017年1月至2020年12月確診的1750例涂陽肺結核患者呼吸道標本中檢測到的1596例結核分枝桿菌菌株結果進行分析，快速分子DST檢測技術與表型DST藥敏檢測的利福平、異煙肼一致率分別達96.62%、95.24%，差異無統計學意義（P>0.05）。提示在臨床上可通過擴大分子檢測技術作為初始診斷工具，將所有肺結核患者的初次痰標本、肺泡灌洗液等呼吸道標本納入分子檢測初始診斷范圍，加大在基層醫院的推廣應用，才能確保所有診斷為耐藥（MR-TB）、耐多藥（MDR/RR-TB）的患者早期納入治療，改變耐藥結核納入治療率低的現狀。2019年全球納入治療的患者比例僅占估算MDR/RR-TB患者數的38%。研究發現，嘉興市的耐多藥率僅為2.13%，低于浙江省耐多藥結核發病率，證實了嘉興市擴大分子初始檢測策略遏制耐藥結核傳播的有效性。
本研究結果還顯示，雖是同一標本平行檢測，也存在著分子檢測與表型藥敏檢測結果不一致的現象，尚有54例利福平（3.38%），76例異煙肼（4.76%）檢測結果不一致，給臨床個體治療方案的選擇帶來困惑，也是現階段耐藥結核治愈率低的因素之一。WHO報告顯示，2019年全球耐藥結核病治療成功率僅為57%。因此，需認真查找分子DST檢測與表型DST藥敏檢測結果不一致的原因，及時分析，調整每一例耐藥結核患者的治療方案，盡早盡快實施個體化精準診療策略，才能提升治愈率。
本研究涉及到的54例利福平，76例異煙肼患者，針對兩種檢測結果不一致的原因分析如下：
①檢測標本是否一致。仔細查找發現2例患者分子檢測與表型培養的標本不是同一個檢測標本;1例患者標本因條形碼掃碼差錯而出現偏差，予重新留取痰標本進行平行檢測。
②檢測技術的局限性。Xpert MTB/RIF、基因芯片快速分子檢測可檢測到結核分枝桿菌的核酸，但無法區別活菌還是死菌;本研究發現其中1例分子檢測敏感，表型藥敏顯示耐藥，原因是操作過程中標本處理不充分，氫氧化鈉時間過長，消化過程中發生了結核分枝桿菌核酸（RNA）降解。1例肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性，表型培養陰性，查找原因發現支氣管鏡檢查消毒清洗不徹底有死菌殘留存在，而Xpert MTB/RIF檢測DNA敏感度高所致。另外，還需分析在檢測過程中是否存在分子檢測系統的故障、溫度的錯誤、試劑盒儲存不合理等因素。表型固體培養存在絕對濃度法偏差較大、選取菌落時操作不當等因素。液體960自動培養時吡嗪酰胺（PZA）藥敏菌株過量，在代謝過程產生大量氨類物質，從而使整個液體培養環境的pH值升高，導致PZA失去殺菌能力而造成假陽性結果。可能導致其藥敏試驗結果重復性差，造成PZA分子與表型藥敏結果不一致。
③不同突變類型與耐藥相關性。從突變位點分析，發現1例快速分子檢測利福平（RFP）基因ropB位點526（A-G）突變、3例利福平（RFP）511（T-C）位點分子檢測陽性，而表型藥敏檢測并不耐藥;1例利福平（RFP）基因533（T-C）、2例531（C-G）、1例526（A-T）位點突變不一致，提示基因突變位點不同，與表型藥敏試驗的相關性也是不同的。郭晶等研究顯示，基因突變在不同年齡組人群中存在一定的差異。個別突變位點還應當結合臨床治療情況進行觀察與分析，不同突變位點應當結合患者的藥敏試驗結果與整體治療情況進行個體化治療。
④靜默突變。沉默子突變只是改變核苷酸位點而不改變編碼蛋白質性質，此時Xpert MTB/RIF檢測結果表現為利福平假陽性，表型培養藥敏敏感;這些Xpert MTB/RIF檢測假陽性患者給予一線抗結核藥物仍然有成功治愈的可能，臨床需謹慎甄別。
⑤異質性耐藥。異質性耐藥是指在臨床同一類患者體內分離出結核分枝桿菌樣本中同時存在敏感和耐藥菌株，敏感和耐藥菌株共同感染或敏感株部分亞群發生耐藥突變所致。當存在異質性耐藥的MTB中耐藥亞群比例高于分子檢測的敏感度時，臨床檢測出并判斷為耐藥;當耐藥亞群比例低于分子檢測敏感度時，就會判讀為敏感，導致部分MTB的分子檢測與表型耐藥檢測結果不一致。本研究結果顯示，有22例快速分子檢測利福平（RFP）敏感，表型藥敏檢測耐藥，分子檢測假敏感可能與異質性耐藥有關。分子檢測需達到≥20%以上的耐藥亞群時才能檢測出，而表型藥敏可檢測出1%的耐藥菌株。異質性耐藥反映了MTB群體從部分耐藥向全體耐藥轉變的中間過程。
⑥基因突變以外的其他耐藥機制引起的MTB耐藥。另外2例異煙肼（INH）、利福平（RFP）分子檢測敏感但表型藥敏耐藥不一致的原因不明，可能存在藥物外排泵、MTB細胞壁增厚難以穿透、抗結核藥物失活等由基因突變以外的其他耐藥機制所致。
綜上所述，分子DST檢測及表型DST藥敏診斷技術的應用，給“終結結核病策略”提供了診斷工具，給臨床耐藥結核病的治療帶來了診斷“金標準”。建議在有條件的定點醫院結核病實驗室可使用兩種檢測方法平行檢測以提高精準度;當臨床檢測中發現初始分子檢測與表型藥敏結果不一致時，應認真分析原因、及時調整治療方案、實施個體化精準診療策略，提高耐藥結核患者的治愈率。