撒壩豬耳緣組織成纖維細胞系生長曲線、生物污染檢測結果——結果與分析、討論
2結果與分析
2.1撒壩豬成纖維細胞形態學觀察
組織塊培養5 d左右，成纖維細胞和少量類上皮細胞從組織塊周圍移出生長。隨著培養時間延長，大量成纖維細胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細胞呈典型的長梭形。當細胞長至培養瓶(皿)底壁80%左右時，進行消化并傳代培養。細胞傳代后，生長加快，3～4 d細胞即可長滿瓶底而再次傳代。原代細胞及傳代后細胞的培養結果見圖1。
圖1撒壩豬成纖維細胞A：原代細胞(20 X)B：第5代細胞(20X)
2.2撒壩豬耳緣成纖維細胞凍存前及復蘇后細胞活率
撒壩豬耳緣組織成纖維細胞凍存前活率為94.16%，復蘇后活率為91.12%，細胞在凍存前和復蘇后都有較高的存活率，達到90%以上，表明細胞在生長時健康狀況良好，培養條件適宜。另外，凍存對其存活率影響不大。
2.3撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析
撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析結果如圖2所示：細胞與細胞之間排列疏松，無緊密連接和橋粒，胞質內有豐富的細胞器，胞核呈長梭形，常染色質較為豐富。圖2A黃色箭頭所示為表皮層和真皮層的皮膚類細胞，為橢圓形。圖2A、2B紅色箭頭所示為位于基底層的成纖維細胞，為長梭型。
圖2撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析(黃色箭頭所示皮膚類細胞，紅色箭頭所示為成纖維細胞)
2.4撒壩豬成纖維細胞生長的動態觀察
每天計數結果取平均值，繪制撒壩豬成纖維細胞生長曲線呈“S”型(圖3)，細胞有約3d的緩慢生長期。此后進入指數生長期，第7天細胞數達最大。然后細胞生長進入平頂期，此時由于細胞密度增大，細胞生長受接觸抑制的影響，細胞開始衰老凋亡。
圖3撒壩豬成纖維細胞的生長曲線
2.5撒壩豬成纖維細胞核型分析
參照Levan[7]等的標準，第3代細胞核型取100個分裂相進行統計分析。結果顯示，撒壩豬染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為92.56%。說明所培養的細胞遺傳性能穩定，該細胞系為穩定的二倍體細胞系。
圖4撒壩豬核型圖(母)(1000x)
2.6撒壩豬成纖維細胞系微生物污染檢測結果
2.6.1細菌、真菌污染檢測結果
接種細胞的液體培養基和陰性對照一樣，沒有混濁，而陽性對照表現有明顯微生物生長。
2.6.2病毒檢測結果
紅細胞吸附實驗結果為陰性。日常相差顯微鏡觀察，未見有病毒造成的細胞損傷現象。
2.6.3支原體檢測結果
實驗采用Hoechst 33342 DNA熒光染色法，未檢查到撒壩豬成纖維細胞被支原體污染。實驗組細胞經Hoechst33342熒光染色后，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點。如圖5 A所示。陽性對照組經Hoechst33342熒光染色后，可見細胞核與細胞膜及其周圍均可見散在的藍色熒光顆粒所圖5 B所示。證明我實驗室建立的撒壩豬成纖維細胞系支原體檢測呈陰性。
圖5撒壩豬成纖維細胞支原體檢測
3討論
據張利娟等報道，豬的染色體數目為2n=38。我們的實驗結果表明撒壩豬的染色體數目為2n=38，與上述結論一致。撒壩豬成纖維細胞體外培養中，隨著傳代次數的增加，生長速度會變慢。此外，細胞的二倍體染色體數目正常的比例呈逐步下降的趨勢，細胞遺傳穩定性有所改變?？赡苁怯捎诩毎旧矶肆Ｃ搁L度的縮短或者體外培養環境對細胞的DNA造成的損傷。而本實驗要求培養的細胞始終維持二倍體生物學性狀，保持與體內細胞相似性較大，因此不能傳代太多，傳2～3代細胞不用于實驗就立即低溫凍存。對原代細胞以及復蘇后細胞中染色體眾數進行檢測，2n=38的占90%以上，染色體沒有異常表現，說明該細胞系為穩定二倍體細胞系。
核型制備過程中，固定和滴片是核型分散成功的保證，適當的滴片高度也是染色體分散良好的重要條件。撒壩豬成纖維細胞核型制備時，用0.25μg/mL終濃度的秋水仙胺處理細胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m滴片，能夠得到分散度好、數量多的細胞中期染色體。撒壩豬染色體長度的測定計算中，實驗對多個中期染色體分裂相進行了觀察、分析、比對。實驗結果表明，撒壩豬的染色體2n=38，與其它豬的染色體相似。
本研究從撒壩豬耳緣組織中分離、培養并建立了成纖維細胞系。通過形態學觀察結果看，細胞為長梭形，絕大多數是成纖維細胞，其中含有少量其他類型的細胞，如上皮細胞。由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶耐受性不同。因此，利用此差別，通過幾次傳代后，就可得到純化的成纖維細胞。
低溫保存技術是生物科學的一門分支學科，是指將體外培養物懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定冷凍速率(或不同溫度梯度應用不同的冷凍速率，并且有一定的保持時間)降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫)，此溫度能夠維持生物樣本活性暫停，進而可以長期保存。細胞保存過程中，需要盡可能降低細胞內冰晶的形成，從而保持解凍后細胞活性、黏附能力及代謝活性。本試驗采用10%DMSO加培養液來凍存細胞，凍存前細胞活率為94.16%，復蘇后的細胞活率91.12%，細胞復蘇后10～15 h可見細胞貼壁；復蘇后第2天更換培養液，2～3 d長滿培養瓶。說明凍存的各項條件對細胞損傷不大，撒壩豬成纖維細胞可在液氮凍存，解凍后細胞可繼續傳代培養，活率與凍存前相比相差不大?？梢杂迷摲ū４嫒鰤呜i這種優良的動物遺傳資源。
綜上所述，本研究建立的撒壩豬耳緣組織成纖維細胞系增殖快，遺傳性質穩定。該細胞系的建立，使撒壩豬這一國家重要遺傳資源在細胞水平上得以保存下來，并為相關遺傳學研究提供了有效的理論依據和理想的生物材料。同時對于開展其他動物成纖維細胞系的建立也有一定的理論和技術指導意義。