適用于低鹽發酵香腸葡萄球菌與乳酸菌生長特性及產酸能力測定及篩選（三）
2結果與分析
2.1優良葡萄球菌菌株初篩結果
從5種自然發酵食品中分離出平板培養形態不同的疑似菌株共56株，其中6株來自川味臘肉，4株來自歐力波蘭薩拉米，1株來自廣味掛腸，15株來自農家煙熏老臘肉，30株來自川味土豬臘腸。從疑似菌株中篩選出革蘭氏陽性球菌、接觸酶陽性菌39株，初步判定為葡萄球菌。
對所得的39株菌株的安全性進行溶血實驗，結果表明，39株菌均為溶血實驗陰性，說明分離的球菌均具有安全性。39株菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，僅2株球菌對150 mg/kg NaNO2不耐受；其中34株菌具有硝酸鹽還原酶，且其中的23株可耐受pH 5.0的酸度，經過初篩，得到發酵特性良好的優良葡萄球菌23株，作為下一步復篩的出發菌株。其中菌株L1、L2、L3來自川味臘肉，R1、R2、R3來自歐力波蘭薩拉米，Z7、Z9、Z10、Z12來自農家煙熏老臘肉，C6、C7、C8、C10、C11、C16、C17、C23、C24、C25、C26、C29、C30來自川味土豬臘腸。
2.2優良葡萄球菌菌株復篩結果
表1葡萄球菌菌株復篩結果
對初篩所得的23株葡萄球菌進行復篩，由表1可知，其中有17株菌既不產氨基酸脫羧酶，也不產精氨酸雙水解酶，這17株菌中有15株菌具有脂肪酶活性，14株菌具有蛋白酶活性，而既產蛋白酶又產脂肪酶的菌株有12株，其中有3株產乙偶姻。因此，最終篩選出3株具有優良風味特性的葡萄球菌，它們分別為篩選自川味臘肉的L2、篩選自歐力波蘭薩拉米的R2以及篩選自農家煙熏老臘肉的Z9。
2.3優良乳酸菌菌株初篩結果
從6種自然發酵食品中分離出的平板培養形態不同的疑似菌共52株，其中25株來自郭三酸菜，7株來自歐力波蘭薩拉米，5株來自北京紫光園自制酸乳，4株來自秦烹小院自制酸乳，7株來自漁夫南湘菜館自制酸乳，3株來自一口酸牛奶（鼓樓東大街店）的自制乳酸菌飲料。從疑似菌株中篩選出具溶鈣圈的革蘭氏陽性、接觸酶陰性乳酸菌30株。
所得30株乳酸菌菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，其中有28株菌可耐受150 mg/kg亞硝酸鹽。不同菌株的產酸情況差異較大，部分產酸較快菌株在MRS培養基中培養24 h，pH值可達3.67，其中21株菌的pH值可在24 h內降至3.70～3.90，產酸效果較好。經過初篩，得到發酵特性良好的優良乳酸菌21株，作為下一步復篩的出發菌株。其中菌株P1、P2、P4、P5、P6、P8、P9、P12、P15、P19、P20、P21來自于郭三酸菜，S1來自于歐力波蘭薩拉米，SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-5來自于北京紫光園自制酸乳，SN2-6、SN2-7、SN2-8來自于秦烹小院自制酸乳，X來自于一口酸牛奶自制乳酸菌飲料。
2.4優良乳酸菌菌株復篩結果
表2乳酸菌菌株復篩結果
對初篩所得的21株乳酸菌進行復篩，經過抑菌實驗，所有菌株均對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌有抑制作用。由表2可知，根據抑菌圈的大小，其中10株乳酸菌的抑菌作用最強（抑菌圈平均寬度大于3 mm）。在進行復篩的21株菌中，氨基酸脫羧酶陰性的菌株有12株，精氨酸雙水解酶陰性的菌株有18株，具有蛋白酶活性有7株。因此，最終篩選出4株兼具多種優良特性的乳酸菌菌株，分別為篩選自郭三酸菜的P6與P12、篩選自北京紫光園自制酸乳的SN1-3以及篩選自一口酸牛奶自制乳酸菌飲料的X。
2.5菌株的分類學鑒定結果
2.5.1菌株形態學鑒定結果
圖1葡萄球菌菌落形態特征
由圖1可知，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9在NB固體培養基上37℃培養24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態均呈白色圓形，不透明，形狀規則，其中L2、R2菌落光滑、濕潤、呈凸起狀，Z9菌落邊緣粗糙，質地干燥且菌落比較扁平。
圖2葡萄球菌菌體形態學特征（×1 000）
由圖2可知，經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9的菌體細胞均為圓球形，革蘭氏陽性，其中菌株L2部分成對生長，菌株R2單個生長，菌株Z9呈不規則堆狀排列。
圖3乳酸菌菌落形態特征
由圖3可知，乳酸菌菌株P6、P12、SN1-3及X在MRS固體培養基上37℃培養24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態均為白色圓形，菌落表面光滑，濕潤凸起，邊緣規則，其中X菌落呈半透明狀，P6、P12、SN1-3菌落均不透明。
圖4乳酸菌菌體形態學特征（×1 000）
由圖4可知，經革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，乳酸菌菌株P6細胞成對或成短鏈，革蘭氏陽性，粗短桿狀；菌株P12成對或成短鏈，為革蘭氏陽性短桿菌；菌株SN1-3細胞部分以直二個方向形成四聯排列，為革蘭氏陽性球菌；菌株X成對或成短鏈，為革蘭氏陽性桿菌。
2.5.2菌株生理生化實驗鑒定結果
表3葡萄球?菌菌株生理生化實驗結果
由表3可知，參考《常見細菌系統鑒定手冊》，根據葡萄球菌生理生化鑒定結果，初步推斷葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，R2為肉葡萄球菌。
表4乳酸菌菌株生理生化實驗結果
由表4可知，參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《乳酸細菌現代研究實驗技術》，根據乳酸菌菌株的生理生化鑒定結果，初步推斷乳酸菌菌株P6、P12為植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌、X為干酪乳桿菌、SN1-3為戊糖片球菌。
2.5.3菌株的16S rDNA分子生物學鑒定結果
圖5菌株16S rDNA的PCR擴增產物電泳圖
由圖5可知，對菌株的16S rDNA序列采用通用引物進行擴增后，在1 000～2 000 bp之間可見到清晰明亮的條帶，大小約為1 500 bp。
利用NCBI網站的BLAST程序對菌株16S rDNA測序結果在GenBank已知序列數據庫中進行對比分析。結果表明：葡萄球菌菌株L2、Z9與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）具有最高同源性，葡萄球菌菌株R2與肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有最高同源性；乳酸菌菌株P6、P12與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）具有最高同源性，乳酸菌菌株X與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有最高同源性，乳酸菌菌株SN1-3與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）具有最高同源性。選取與GenBank中相似性較高菌株的序列，利用MEGA 6.0軟件進行系統發育樹的構建，結果如圖6～8所示。
圖6葡萄球菌菌株L2、R2、Z9的系統發育樹
圖8乳酸菌菌株SN1-3的系統發育樹
綜合生理生化及分子生物學鑒定，結果表明，葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，葡萄球菌菌株R2為肉葡萄球菌；乳酸菌菌株P6、P12為植物乳桿菌，菌株X為干酪乳桿菌，SN1-3為戊糖片球菌。