適用于低鹽發(fā)酵香腸葡萄球菌與乳酸菌生長特性及產(chǎn)酸能力測定及篩選（三）
2結(jié)果與分析
2.1優(yōu)良葡萄球菌菌株初篩結(jié)果
從5種自然發(fā)酵食品中分離出平板培養(yǎng)形態(tài)不同的疑似菌株共56株，其中6株來自川味臘肉，4株來自歐力波蘭薩拉米，1株來自廣味掛腸，15株來自農(nóng)家煙熏老臘肉，30株來自川味土豬臘腸。從疑似菌株中篩選出革蘭氏陽性球菌、接觸酶陽性菌39株，初步判定為葡萄球菌。
對所得的39株菌株的安全性進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，39株菌均為溶血實(shí)驗(yàn)陰性，說明分離的球菌均具有安全性。39株菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，僅2株球菌對150 mg/kg NaNO2不耐受；其中34株菌具有硝酸鹽還原酶，且其中的23株可耐受pH 5.0的酸度，經(jīng)過初篩，得到發(fā)酵特性良好的優(yōu)良葡萄球菌23株，作為下一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。其中菌株L1、L2、L3來自川味臘肉，R1、R2、R3來自歐力波蘭薩拉米，Z7、Z9、Z10、Z12來自農(nóng)家煙熏老臘肉，C6、C7、C8、C10、C11、C16、C17、C23、C24、C25、C26、C29、C30來自川味土豬臘腸。
2.2優(yōu)良葡萄球菌菌株復(fù)篩結(jié)果
表1葡萄球菌菌株復(fù)篩結(jié)果
對初篩所得的23株葡萄球菌進(jìn)行復(fù)篩，由表1可知，其中有17株菌既不產(chǎn)氨基酸脫羧酶，也不產(chǎn)精氨酸雙水解酶，這17株菌中有15株菌具有脂肪酶活性，14株菌具有蛋白酶活性，而既產(chǎn)蛋白酶又產(chǎn)脂肪酶的菌株有12株，其中有3株產(chǎn)乙偶姻。因此，最終篩選出3株具有優(yōu)良風(fēng)味特性的葡萄球菌，它們分別為篩選自川味臘肉的L2、篩選自歐力波蘭薩拉米的R2以及篩選自農(nóng)家煙熏老臘肉的Z9。
2.3優(yōu)良乳酸菌菌株初篩結(jié)果
從6種自然發(fā)酵食品中分離出的平板培養(yǎng)形態(tài)不同的疑似菌共52株，其中25株來自郭三酸菜，7株來自歐力波蘭薩拉米，5株來自北京紫光園自制酸乳，4株來自秦烹小院自制酸乳，7株來自漁夫南湘菜館自制酸乳，3株來自一口酸牛奶（鼓樓東大街店）的自制乳酸菌飲料。從疑似菌株中篩選出具溶鈣圈的革蘭氏陽性、接觸酶陰性乳酸菌30株。
所得30株乳酸菌菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，其中有28株菌可耐受150 mg/kg亞硝酸鹽。不同菌株的產(chǎn)酸情況差異較大，部分產(chǎn)酸較快菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，pH值可達(dá)3.67，其中21株菌的pH值可在24 h內(nèi)降至3.70～3.90，產(chǎn)酸效果較好。經(jīng)過初篩，得到發(fā)酵特性良好的優(yōu)良乳酸菌21株，作為下一步復(fù)篩的出發(fā)菌株。其中菌株P(guān)1、P2、P4、P5、P6、P8、P9、P12、P15、P19、P20、P21來自于郭三酸菜，S1來自于歐力波蘭薩拉米，SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-5來自于北京紫光園自制酸乳，SN2-6、SN2-7、SN2-8來自于秦烹小院自制酸乳，X來自于一口酸牛奶自制乳酸菌飲料。
2.4優(yōu)良乳酸菌菌株復(fù)篩結(jié)果
表2乳酸菌菌株復(fù)篩結(jié)果
對初篩所得的21株乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)過抑菌實(shí)驗(yàn)，所有菌株均對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌有抑制作用。由表2可知，根據(jù)抑菌圈的大小，其中10株乳酸菌的抑菌作用最強(qiáng)（抑菌圈平均寬度大于3 mm）。在進(jìn)行復(fù)篩的21株菌中，氨基酸脫羧酶陰性的菌株有12株，精氨酸雙水解酶陰性的菌株有18株，具有蛋白酶活性有7株。因此，最終篩選出4株兼具多種優(yōu)良特性的乳酸菌菌株，分別為篩選自郭三酸菜的P6與P12、篩選自北京紫光園自制酸乳的SN1-3以及篩選自一口酸牛奶自制乳酸菌飲料的X。
2.5菌株的分類學(xué)鑒定結(jié)果
2.5.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果
圖1葡萄球菌菌落形態(tài)特征
由圖1可知，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9在NB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態(tài)均呈白色圓形，不透明，形狀規(guī)則，其中L2、R2菌落光滑、濕潤、呈凸起狀，Z9菌落邊緣粗糙，質(zhì)地干燥且菌落比較扁平。
圖2葡萄球菌菌體形態(tài)學(xué)特征（×1 000）
由圖2可知，經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9的菌體細(xì)胞均為圓球形，革蘭氏陽性，其中菌株L2部分成對生長，菌株R2單個(gè)生長，菌株Z9呈不規(guī)則堆狀排列。
圖3乳酸菌菌落形態(tài)特征
由圖3可知，乳酸菌菌株P(guān)6、P12、SN1-3及X在MRS固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態(tài)均為白色圓形，菌落表面光滑，濕潤凸起，邊緣規(guī)則，其中X菌落呈半透明狀，P6、P12、SN1-3菌落均不透明。
圖4乳酸菌菌體形態(tài)學(xué)特征（×1 000）
由圖4可知，經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，乳酸菌菌株P(guān)6細(xì)胞成對或成短鏈，革蘭氏陽性，粗短桿狀；菌株P(guān)12成對或成短鏈，為革蘭氏陽性短桿菌；菌株SN1-3細(xì)胞部分以直二個(gè)方向形成四聯(lián)排列，為革蘭氏陽性球菌；菌株X成對或成短鏈，為革蘭氏陽性桿菌。
2.5.2菌株生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果
表3葡萄球?菌菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表3可知，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，根據(jù)葡萄球菌生理生化鑒定結(jié)果，初步推斷葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，R2為肉葡萄球菌。
表4乳酸菌菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表4可知，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌現(xiàn)代研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，根據(jù)乳酸菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果，初步推斷乳酸菌菌株P(guān)6、P12為植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌、X為干酪乳桿菌、SN1-3為戊糖片球菌。
2.5.3菌株的16S rDNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果
圖5菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
由圖5可知，對菌株的16S rDNA序列采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增后，在1 000～2 000 bp之間可見到清晰明亮的條帶，大小約為1 500 bp。
利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序?qū)?6S rDNA測序結(jié)果在GenBank已知序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明：葡萄球菌菌株L2、Z9與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）具有最高同源性，葡萄球菌菌株R2與肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有最高同源性；乳酸菌菌株P(guān)6、P12與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）具有最高同源性，乳酸菌菌株X與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有最高同源性，乳酸菌菌株SN1-3與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）具有最高同源性。選取與GenBank中相似性較高菌株的序列，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖6～8所示。
圖6葡萄球菌菌株L2、R2、Z9的系統(tǒng)發(fā)育樹
圖8乳酸菌菌株SN1-3的系統(tǒng)發(fā)育樹
綜合生理生化及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，葡萄球菌菌株R2為肉葡萄球菌；乳酸菌菌株P(guān)6、P12為植物乳桿菌，菌株X為干酪乳桿菌，SN1-3為戊糖片球菌。
相關(guān)新聞推薦
1、352株盆腔炎支原體對12種抗生素藥物敏感性試驗(yàn)分析