空腸彎曲菌噬菌體生物學(xué)特性測定及生長曲線繪制（二）
1.5.5噬菌體對宿主菌生長的抑制作用
分別將1 mL對數(shù)期的空腸彎曲菌液(1.0×107CFU/mL)與1 mL稀釋不同濃度的噬菌體液，分別按照感染復(fù)數(shù)為0.01，0.10，1.00的比例混合接種至20 mL MH肉湯。對照組為1 mL不含噬菌體的樣品。在42℃微需氧搖床120 r/min培養(yǎng)24 h，每隔6 h測量混合物的OD600值。每次做3組平行。
1.5.6噬菌體裂解譜測定
噬菌體的裂解譜測定采用點(diǎn)斑法。取100μL宿主菌液，包括空腸彎曲菌2206，空腸彎曲菌CICC 22936，沙門氏菌14028，銅綠假單胞菌PA01，銅綠假單胞菌PA14，枯草芽孢桿菌WB800于5 mL半固培養(yǎng)基中，混勻后倒置于平板中。取5μL噬菌體液點(diǎn)滴到含有不同菌液的雙層平板上。過夜培養(yǎng)觀察有無噬菌斑。
1.6噬菌體基因組測序與分析
用病毒基因組DNA提取試劑盒提取噬菌體vB_Cj_QDYZ的DNA，送至上海凌恩生物公司進(jìn)行測序。使用RAST軟件對噬菌體進(jìn)行基因預(yù)測，確定全基因組所有的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。根據(jù)BLASTp比對工具進(jìn)行蛋白比對，推測每個(gè)ORF最相近的蛋白功能，即完成噬菌體的全基因組功能注釋。
使用BLASTn對噬菌體vB_Cj_QDYZ的全基因組進(jìn)行比對，并下載相似性較高的空腸彎曲菌噬菌體基因組，構(gòu)建全基因組水平的進(jìn)化樹。使用BLASTp對噬菌體vB_Cj_QDYZ的主要衣殼蛋白序列、內(nèi)溶素序列進(jìn)行比對，利用MEGA 7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.7噬菌體在牛奶中的抑菌效果
將500μL濃度為1.0×106CFU/mL的空腸彎曲菌液與500μL噬菌體增殖液(1.0×108PFU/mL)混合于5 mL牛奶中，在42℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。對照組為500μL無菌PBS緩沖液。分別于0 h和4 h取出樣品，對其進(jìn)行梯度稀釋，在合適梯度吸取100μL涂布于哥倫比亞血平板上，42℃微需氧條件培養(yǎng)24～36 h，并計(jì)算哥倫比亞血平板上的空腸彎曲菌的單菌落總數(shù)。細(xì)菌數(shù)的計(jì)算如公式(1)所示:
細(xì)菌數(shù)/(CFU/mL)=菌落計(jì)數(shù)×10×稀釋倍數(shù)(1)
2結(jié)果與分析
2.1空腸彎曲菌噬菌體的分離和純化
通過雙層平板法分離得到一株空腸彎曲菌的裂解性噬菌體。根據(jù)宿主菌及分離樣品來源，將噬菌體命名為vB_Cj_QDYZ。經(jīng)過6輪純化，噬菌斑的大小和形態(tài)比較一致，如圖1-A所示，它們的直徑僅為1～2 mm，邊緣光滑，沒有任何暈環(huán);噬菌斑清晰透亮，說明噬菌體的裂解能力較強(qiáng)。
A-噬菌斑形態(tài);B-噬菌體的透射電鏡形態(tài)
圖1噬菌體vB_Cj_QDYZ的形態(tài)特征
2.2噬菌體透射電鏡形態(tài)觀察
如圖1-B所示，噬菌體vB_Cj_QDYZ在透射電子顯微鏡下，有一個(gè)正二十面體的頭部(直徑約100.81 nm)和一條可伸縮的尾部(長度約65.90 nm)。根據(jù)ICTV第九次病毒類型研究報(bào)告，噬菌體vB_Cj_QDYZ屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科。目前大多數(shù)彎曲菌噬菌體都是肌尾噬菌體，具有終端泡和空頭結(jié)構(gòu)，有肌鞘并且可收縮。只有極少數(shù)彎曲菌噬菌體是長尾和短尾噬菌體。
2.3噬菌體的生物學(xué)性質(zhì)
2.3.1噬菌體的熱穩(wěn)定性
如圖2-A所示，噬菌體vB_Cj_QDYZ在30～60℃效價(jià)較穩(wěn)定，且維持較高水平，大約為107PFU/mL。當(dāng)噬菌體在70℃和80℃條件下孵育30 min，噬菌體效價(jià)明顯降低至102PFU/mL;孵育60 min時(shí)，噬菌體完全失活。綜上，噬菌體vB_Cj_QDYZ的溫度耐受范圍為30～60℃。
A-噬菌體的溫度穩(wěn)定性;B-噬菌體的pH穩(wěn)定性;C-噬菌體的一步生長曲線;D-噬菌體對宿主的生長抑制作用
圖2噬菌體vB_Cj_QDYZ的生物學(xué)特性
2.3.2噬菌體的pH穩(wěn)定性
如圖2-B所示，噬菌體vB_Cj_QDYZ在pH值為3～12時(shí)效價(jià)較穩(wěn)定，基本維持在大約106PFU/mL。當(dāng)噬菌體在pH=2的酸性環(huán)境或者pH=13的堿性環(huán)境孵育2 h后，完全失活。綜上，噬菌體vB_Cj_QDYZ的pH值耐受范圍是3～12。
2.3.3噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)
根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)，噬菌體的效價(jià)達(dá)到最高，為2.07×108PFU/mL，因此vB_Cj_QDYZ的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。
表1噬菌體vB_Cj_QDYZ最佳感染復(fù)數(shù)
表2噬菌體vB_Cj_QDYZ的裂解譜
2.3.4噬菌體的一步生長曲線
噬菌體的一步生長曲線主要由潛伏期、裂解期和平穩(wěn)期組成。如圖2-C所示，噬菌體的潛伏期是60 min。從第60 min以后，噬菌體的效價(jià)突然大規(guī)模增加，呈現(xiàn)指數(shù)式增長，因此噬菌體的裂解期是150 min。在最后的60 min，噬菌體的效價(jià)不再出現(xiàn)明顯改變，此階段為平穩(wěn)期。爆發(fā)量是由噬菌體的效價(jià)和宿主菌的數(shù)量決定的。在爆發(fā)末期，噬菌體的效價(jià)大約為4.5×108PFU/mL，而感染初期宿主菌的含量為1.0×107CFU/mL，因此爆發(fā)量為45 PFU/cell。
2.3.5噬菌體對宿主菌的生長抑制作用
由圖2-D可知，噬菌體vB_Cj_QDYZ與空腸彎曲菌2206在不同感染復(fù)數(shù)混合培養(yǎng)后，初始OD600值基本相同，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在微需氧條件培養(yǎng)第6 h時(shí)，對照組OD600值已達(dá)到0.145，加了不同濃度噬菌體組的OD600值是0.08。在培養(yǎng)第24 h，對照組OD600值為0.434，噬菌體組依然是0.08。表明噬菌體可在不同MOI下高效裂解宿主菌，噬菌體具有很強(qiáng)的裂解能力，可以有效抑制宿主菌的生長，具有良好的應(yīng)用前景和抗菌潛力。
2.3.6噬菌體的裂解譜
空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可以裂解實(shí)驗(yàn)室的兩株空腸彎曲菌，點(diǎn)斑法可以產(chǎn)生清晰透亮的噬菌斑。但是對于銅綠假單胞菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的平板，則沒有清晰透亮的噬菌斑產(chǎn)生。充分說明空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的特異性。研究表明空腸彎曲菌噬菌體的裂解譜相窄，特異性強(qiáng)。
空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可以裂解實(shí)驗(yàn)室的兩株空腸彎曲菌，點(diǎn)斑法可以產(chǎn)生清晰透亮的噬菌斑。但是對于銅綠假單胞菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的平板，則沒有清晰透亮的噬菌斑產(chǎn)生。充分說明空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的特異性。研究表明空腸彎曲菌噬菌體的裂解譜相窄，特異性強(qiáng)。
2.4噬菌體vB_Cj_QDYZ全基因組分析
全基因組測序結(jié)果顯示:噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組為雙鏈DNA，基因組全長為130 627 bp，G+C含量為26%。根據(jù)基因組大小在130～140 kbp，推斷該噬菌體為Ⅲ組空腸彎曲菌噬菌體，屬于CP8 virus。研究表明Ⅲ組噬菌體是目前分離最多、抑菌效果最好的空腸彎曲菌噬菌體。
在噬菌體全基因組中不含抗生素耐藥基因、過敏原基因和毒力因子。進(jìn)一步說明該噬菌體應(yīng)用的安全性，具有良好的應(yīng)用前景和抗菌潛力。噬菌體vB_Cj_QDYZ在NCBI上的序列號為OQ515481.1。
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