紅螯螯蝦源布氏檸檬酸桿菌分離鑒定和耐藥性分析（一）
布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)屬于檸檬桿菌屬，為人和動物體內常見菌群，是一種條件性致病菌。在機體免疫力降低時，布氏檸檬酸桿菌可以感染包括人在內的多種生物，常引起患者嘔吐、腹瀉和高燒，嚴重者會引起膽囊炎或者急性腹膜炎。患病蝦類則出現活動力差、螯足無力、食欲下降和應激遲緩，并伴有頭甲下大量腹水和肝胰腺腫大等。近年來，人類感染布氏檸檬酸桿菌的相關報道越來越多，但罕見從紅螯螯蝦中分離到布氏檸檬酸桿菌的相關報道。本試驗于2021年1月，自紅螯螯蝦腸道內分離獲得形態(tài)大小一致的菌落，采用形態(tài)學觀察、生化鑒定、16S rDNA測序和系統(tǒng)進化分析對分離菌株進行鑒定，通過人工感染斑馬魚確定其致病性，以Kirby-Bauer(K-B)紙片擴散法進行藥物敏感性試驗確定其耐藥性，以期為紅螯螯蝦布氏檸檬酸桿菌感染的診斷和治療提供基礎資料。
1材料與方法
1.1病原材料來源
廣西壯族自治區(qū)南寧市吳圩鎮(zhèn)紅螯螯蝦養(yǎng)殖場內活動力差、螯足無力、食欲下降的紅螯螯蝦(采樣地點東經108.152 45°、北緯22.584 52°)。
1.2主要試劑
硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS瓊脂培養(yǎng)基)、LB液體培養(yǎng)基和MH液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術有限公司;細菌總DNA提取試劑盒和PCR擴增試劑盒，均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;16S rDNA通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;微量生化鑒定管，購自杭州微生物試劑有限公司;藥敏紙片，購自常德比克曼生物有限公司。
1.3主要儀器
振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司;生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司;臺式高速冷凍離心機，湘潭湘儀儀器有限公司;聚合酶鏈反應核酸擴增儀，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司;紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。
1.4細菌的分離和純化
在無菌環(huán)境下操作，先用生理鹽水沖洗紅螯螯蝦體表，再用乙醇擦拭，對紅螯螯蝦進行檢剖。取紅螯螯蝦腸道內容物至裝有少量0.9%生理鹽水的無菌EP管中，將腸道內容物進行10倍梯度稀釋，取10μL各梯度稀釋液，用涂布器均勻涂于TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h。根據菌落形態(tài)挑取優(yōu)勢單菌落進行純化培養(yǎng)，經2次以上純化培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于36℃過夜培養(yǎng)，將菌液和甘油按2∶1體積比混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?
1.5細菌的鑒定
菌落形態(tài)觀察:取純化后的分離菌株劃線接種于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，于36℃靜置培養(yǎng)12 h，觀察并記錄單菌落的形狀、大小、邊緣、表面和隆起形狀等表型特征。純化后的單菌落經LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后進行革蘭染色，置于光學顯微鏡下觀察分離菌株的染色特征。
生化鑒定:取純化后的分離菌株于0.9%生理鹽水中稀釋，至0.5麥氏比濁度的菌懸液，取10μL菌懸液加至微量生化鑒定管中，并按照說明書操作進行生化鑒定。
16S rDNA鑒定:使用細菌總DNA提取試劑盒提取純化后分離菌株的總DNA，以16S rDNA通用引物27 F和1492 R進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)鑒定。PCR陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將序列上傳至NCBI進行Blast比對分析，通過MEGA X軟件以最大似然法(Maximum likelihood method，ML)構建系統(tǒng)進化樹。
菌株生長曲線:取純化后的分離菌株至LB液體培養(yǎng)基中，于36℃培養(yǎng)，每隔1 h取適量菌液，于600 nm處使用分光光度計檢測光密度(Optical density，OD)值，連續(xù)檢測38 h，并以時間為橫坐標，OD600 nm值為縱坐標，繪制生長曲線。
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