兔支氣管敗血波氏桿菌藥物敏感性試驗及動物致病性試驗
隨著家兔集約化、規模化養殖的發展，兔支氣管敗血波氏桿菌成為困擾家兔養殖業的重要疾病之一。該病原菌在自然界中分布廣泛，為家兔的呼吸道常在菌，應激或者其他因素導致機體免疫力下降會引起家兔的慢性鼻炎、咽炎、支氣管肺炎及膿包型肺炎等癥狀。該病常發生于春秋季節，不同年齡的家兔均易感。幼兔、仔兔常呈急性型，成年兔一般呈慢性型。一旦兔群發病，能夠通過空氣傳播迅速波及全群，不及時控制該病，能夠導致高達50%的病死率。
2014年3月初山東棗莊某大型養殖場帶病兔來到山東省濱州畜牧獸醫研究院技術服務中心開展疾病診斷。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1病料山東棗莊某兔場送檢病兔。
1.1.2試劑及動物胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養基，美國BD公司產品；試驗用藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術開發中心產品；昆明系小鼠，購自山東大學；試驗用30d健康易感兔，購自濱州某兔場，試驗前取試驗兔鼻拭子進行PCR檢測，無兔支氣管敗血波氏桿菌感染。
1.2方法
1.2.1病兔的剖檢觀察及病料采集
按照常規方法無菌處理家兔體表，觀察臨床癥狀，無菌操作取主要病變部位及肝臟、脾臟等組織，為后期試驗做好準備。
1.2.2病原菌的分離
取主要病變組織肺臟新鮮創面，涂布加血的TSA培養基，同時使用脾臟、肝臟等同樣做細菌的分離鑒定，培養30h左右，觀察分離菌株的生長狀態，并挑取典型菌落涂片，革蘭染色鏡檢。
1.2.3病兔疾病的特異性
PCR病原檢測取肝臟、脾臟、肺臟組織開展兔瘟的PCR檢測，取分離的優勢病原菌開展常見病原菌的多重PCR檢測。
1.2.4藥物敏感性試驗
無菌放置干燥抗菌藥物紙片緊貼于密集劃線接種了菌種的培養基表面，每個直徑90mm的平皿貼7個藥敏紙片，蓋上平皿，倒置平皿置37℃溫箱培養24h，取出測量觀察結果，判斷標準按2010版CLSI M100-S20執行，≤5 mm為不敏感；≥6mm≤10mm為低度敏感；≥11 mm≤20mm為敏感；≥21mm為高度敏感。使用篩選到的敏感藥物配合波氏桿菌疫苗對兔群進行綜合防控。
1.2.5動物致病性試驗
1.2.5.1小鼠的致病性試驗
挑取鑒定純培養的兔支氣管敗血波氏桿菌分離株，接種于成品TSB中37℃培養18h后，活菌倍比稀釋計數，調整濃度至1×109CFU／mL。10只20g左右的健康昆明系小鼠，隨機分成2組，每組5只，1號組腹腔注射0.2mL菌液，2號組腹腔注射等量生理鹽水做對照組，隔離飼養觀察7d。
1.2.5.2 30d家兔的致病性試驗
挑取鑒定純培養的兔支氣管敗血波氏桿菌分離株，接種于成品TSB中37℃培養18h后，活菌計數，調整濃度至1×109CFU／mL。6只30d左右的健康、PCR檢測無波氏桿菌污染的新西蘭白兔，隨機分成2組，每組3只，1號組耳靜脈注射0.2mL菌液，2號組耳靜脈注射等量生理鹽水作為對照組，隔離飼養觀察14d。
2、結果
2.1發病狀況
該批家兔發病日齡約30d，每天有2%左右的死亡率，用過兔瘟疫苗和瘟巴二聯疫苗，沒用過波氏桿菌的疫苗，病兔精神不振、被毛蓬亂，有的兔子流膿性鼻液或黏液。剖檢可以觀察到肺充血水腫，有出血點偶見化膿灶，鼻腔、咽喉部及氣管內有淡黃色黏液，其他臨床癥狀不明顯。
2.2病原菌的分離培養
取病死兔的肺臟、肝臟、脾臟進行病原菌的分離培養；脾臟和肝臟病料在TSA培養基上基本無細菌生長，肺臟病料有兩種菌落生長（經鑒定另一種為大腸埃希菌），其中一種優勢菌菌落光滑致密，呈灰白色突起。經革蘭染色鏡檢為革蘭陰性短小桿菌，大小均一（圖1）。
圖1分離菌的革蘭染色鏡檢（1 000×）
2.3病原菌的PCR種屬鑒定
挑取單菌落進行PCR種屬的鑒定，圖2中顯示可見260bp處有一條目的條帶，可以確定該分離株為兔支氣管敗血波氏桿菌。
圖2波氏桿菌PCR鑒定
2.4藥物敏感試驗
藥敏試驗結果顯示，氟苯尼考、多西環素、紅霉素為高敏藥物；四環素、鏈霉素中敏；對阿莫西林等9種藥物耐藥，試驗數據見表1。
表1藥物敏感性試驗結果
2.5致病性試驗
昆明系小鼠在接種后表現精神沉郁，16h左右時1號攻毒組5只全部死亡，2號對照組一切正常。家兔組1號攻毒組和2號對照組，觀察7d均未死亡，且沒有明顯的癥狀差異，攻毒7d后剖檢觀察，1號攻毒組未出現明顯的肺臟異常，僅鼻腔出現輕微的充血和稍渾濁黏液。證實該分離株對小鼠有一定的致病力，但是對健康家兔致病力不強。
2.6藥物防治
根據病原分離結果及藥敏試驗結果，使用波氏桿菌疫苗緊急防疫并配合氟苯尼考針劑注射，迅速控制了兔群的持續性死亡。
3、討論
根據發病兔中分離菌的培養特性、染色鏡檢、PCR檢測等快速確定病兔肺臟優勢分離病原菌為兔支氣管敗血波氏桿菌。該病原菌對昆明系小鼠具有較強的致病性，但是在使用本動物進行攻毒試驗時，未出現典型的發病和病變，可能和實驗動物中心養殖環境較好有關，在該試驗條件下無法復制發病兔場的應激環境。另外，在本試驗中使用肺臟進行病原菌分離鑒定，其中還有一種細菌經PCR鑒定為大腸埃希菌，其分離率僅為1%～2%，因此，可以確定本次疫情的主要致病菌是兔支氣管敗血波氏桿菌。
兔支氣管敗血波氏桿菌的傳統鑒定方法主要是病原菌的革蘭染色、鏡檢及生化試驗，在本文試驗過程中采用傳統方法和分子生物學相結合的試驗方法，首先使用傳統方法進行革蘭染色鏡檢確定細菌的大致形態，為分子生物學檢測方法指明方向，在此基礎上挑取疑似菌株PCR引物進行鑒定，在短時間內快速確定病原菌株。傳統方法和分子生物學方法相結合，省去了生化試驗的步驟，同時比單純的分子生物學大范圍的篩選鑒定要節約很多試劑和時間，在生產實踐的一線更具有實際應用意義。
本次病例發生的兔場相對規模較大，主要的疫苗如兔瘟疫苗、巴氏桿菌疫苗、產氣莢膜梭菌疫苗等均已經按照防疫程序正常免疫，忽略了波氏桿菌疫苗的防疫，造成了本次疫情的發生。在管理良好的兔場，發生兔波氏桿菌一般較少，但是在天氣變化、飼養人員變動等應激條件下，若場內有波氏桿菌的存在，則會導致兔群暴發該病。本病的預防措施主要是搞好環境衛生，防止外來病原菌的入侵。由于病原菌的入侵途徑的多樣化和不可預測性，不要存在僥幸心理過度相信廠區的管理水平，做好兔群波氏桿菌的正常防疫，提高飼養管理水平，減少兔群應激，降低條件性致病菌的發病概率。
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