鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測及致病潛力（三）
2結果
2.1病原菌的分離培養及鏡檢染色結果
從8份腹瀉鵪鶉糞樣中成功分離到2株疑似菌落，其在LB瓊脂培養基上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊、形狀大而圓的灰白色菌落（圖1A）；在麥康凱瓊脂培養基上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊，形狀小而圓的粉色菌落（圖1B）；在SS瓊脂板上生長為表面光滑濕潤、邊緣整齊的淡粉色菌落（圖1C），在各培養基上均為黏稠狀聚在一起，均伴有臭味。革蘭染色鏡檢呈兩端鈍而圓的紅色短桿狀菌落（圖1D），根據菌株形態可初步判斷2株分離株為肺炎克雷伯菌，分別命名為Ksp-A1和Ksp-A2.A-C,分離株在LB、麥康凱、SS瓊脂平板上的生長情況；D,革蘭染色鏡檢（1000×）
圖1病原菌菌落形態及革蘭染色鏡檢
2.2生化鑒定結果生化鑒定
結果顯示，2株分離菌株苯丙氨酸、鳥氨酸、半固體瓊脂、葡磷胨水、側金盞花醇、硫化氫和蛋白胨水試驗均呈陰性，均能分解木糖、山梨醇、棉子糖，枸櫞酸鈉、尿素、葡萄糖酸鹽、賴氨酸和葡萄糖產氣反應呈陽性（表4），參照腸桿菌科細菌生化反應陽性率表，符合肺炎克雷伯菌生化特性。
表4分離株生化鑒定結果
2.316SrDNA鑒定和遺傳進化分析
利用細菌16SrDNA通用引物對分離菌株進行PCR擴增，結果顯示，獲得大小約1490bp的片段（圖2），大小與預期相符。測序結果BLAST比對顯示，2株分離菌株與肺炎克雷伯菌的相似性達到99.50%-99.93%.系統進化樹結果顯示，分離株均與肺炎克雷伯菌DB-4、WGT-31株屬于同一進化分支（圖3），進一步證明2株分離株為肺炎克雷伯菌。
2.4肺炎克雷伯菌特異性基因檢測結果
對分離株Ksp-A1和Ksp-A2進行PCR擴增，檢測其是否含有腸桿菌科特異性基因phoA與肺炎克雷伯菌特異性基因khe,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，分別獲得大小為720和498bp條帶（圖4），條帶大小符合預期，因此判斷2株分離株均為腸桿菌科肺炎克雷伯菌。
圖2分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）16SrDNAPCR擴增結果
圖3分離株系統進化樹
圖4分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）肺炎克雷伯菌特異性基因PCR檢測結果
2.5肺炎克雷伯菌莢膜血清型檢測結果
2株分離株使用K57莢膜血清型特異性引物均擴增出1100bp左右片段（圖5），片段大小符合預期，因此判斷分離株Ksp-A1和Ksp-A2的莢膜血清型均為K57.M,Trans2KDNAMarker;1,陰性對照；2-8,分別為K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57莢膜血清型
圖5分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）莢膜血清型PCR檢測結果
2.6藥物敏感性檢測結果
由表5可知，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均對苯唑西林、氨芐西林、青霉素、復方新諾明、麥迪霉素和紅霉素表現耐藥，對頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢唑啉、米諾環素、氯霉素、丁胺卡那、環丙沙星和諾氟沙星表現敏感，對頭孢氨芐、羧芐西林、多黏菌素B和新霉素表現中介。Ksp-A1對頭孢拉定、四環素和阿奇霉素表現中介，Ksp-A2對以上抗菌藥表現敏感；Ksp-A2對卡那霉素和慶大霉素表現中介，Ksp-A1對其表現敏感。
表5分離株藥敏試驗結果
2.7耐藥基因檢測結果
使用PCR檢測分離株耐藥基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，分離株Ksp-A1攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat16種耐藥基因；分離株Ksp-A2攜帶blaSHV、aaaA1、aacC2、oqxAB、qnrA、tetA、tetM和cat18種耐藥基因（圖6）。
2.8分離株毒力基因檢測結果
分離株毒力基因檢測顯示，分離株Ksp-A1攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC6種毒力基因，分離株Ksp-A2攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA、ompC和malX7種毒力基因（圖7）。
2.9生物學特性分析
2.9.1生長曲線
由圖8A可知，培養2h后，分離株Ksp-A1和Ksp-A2的D600nm值均逐漸升高，開始進入對數生長期。培養12h時，分離株Ksp-A1的D600nm值達到峰值，隨后進入衰退期。培養9h時，分離株Ksp-A2的D600nm值達到峰值，隨后進入衰退期。
2.9.2酸堿耐受性
由圖8B可知，分離株Ksp-A1、Ksp-A2在pH2.0-10.0均能存活，且pH為7.0時活性最好；當pH<2.0和pH>11.0時分離株Ksp-A1基本失去活性；當pH<2.0和pH>12.0時分離株Ksp-A2基本失去活性。
2.9.3接種量由圖8C可知，分離株Ksp-A1接種量為3%、Ksp-A2接種量為2%和3%時生長狀態最佳。在其他接種量條件下，2株分離株的D600nm值均呈現不同程度的下降，生長狀態較差，因此分離株Ksp-A1的最適接種量為3%、Ksp-A2的最適接種量為2%.
圖6分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）耐藥性基因檢測結果
圖7分離株Ksp-A1（A）和Ksp-A2（B）毒力基因檢測結果
圖8分離株生長曲線（A）、酸堿耐受（B）與接種量（C）測定結果
2.10致病性試驗結果
試驗組小鼠在12h后開始發病，均出現被毛粗亂、精神沉郁、呼吸困難、腹瀉等癥狀。對照組小鼠試驗期間活動正常，未見異常。當分離株Ksp-A1和Ksp-A2菌液濃度為0和1×105CFU/mL時，小鼠死亡率均為0;當菌液濃度為1×106CFU/mL時，Ksp-A1組小鼠死亡率為0,Ksp-A2組小鼠死亡率為10%;當菌液濃度為1×107CFU/mL時，Ksp-A1組小鼠死亡率為30%,Ksp-A2組小鼠死亡率為60%;當菌液濃度為1×108CFU/mL時，Ksp-A1組小鼠死亡率為70%,Ksp-A2組小鼠死亡率為90%;當菌液濃度為1×109CFU/mL時，Ksp-A1和Ksp-A2組小鼠死亡率均達到100%（表6）。經計算得出，分離株Ksp-A1和Ksp-A2對小鼠的LD50分別為3.3×107和2.6×106CFU.
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